Диагностическая и прогностическая роль экзосомальных микроРНК при колоректальном раке

Сводная таблица микроРНК, изученных у больных колоректальным раком

Введение

В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями в 2020 г. среди мужского населения РФ удельный вес колоректального рака (КРР) (рак ободочной и прямой кишки, ректосигмоидного соединения и ануса) составил 12,6%, среди женского – 12,0%. Общий темп прироста с 2010 по 2020 г. в популяции достиг 47,8%. Ежегодно в мире регистрируется 1,9 млн случаев заболевания КРР. Смертность также остается высокой. По данным Всемирной организации здравоохранения, от КРР в 2020 г. умерли 935 173 пациента, в частности в РФ – 18 678 [1, 2].

Программы скрининга КРР в России на первом этапе предусматривают исследование кала на скрытую кровь и эндоскопическое исследование толстой кишки у пациентов группы высокого риска. Однако данный алгоритм имеет ряд существенных ограничений. Недостаточная чувствительность и специфичность исследования кала на скрытую кровь обусловливают выпадение из поля зрения врачей пациентов с предраковыми заболеваниями толстого кишечника или начальной стадией КРР. В то же время необходимость проведения инвазивной диагностики среди широкого круга пациентов создает дополнительную нагрузку на общую лечебную сеть, что требует поиска более специфичных и чувствительных маркеров заболевания [3, 4].

Использование РЭА и СА 19-9 в качестве молекулярных маркеров на этапе скрининга нецелесообразно: статистически значимые отличия от референсных значений имеют место лишь у пациентов с III–IV стадией заболевания [5].

Жидкостная биопсия – малоинвазивная методика, характеризующаяся низкой стоимостью и высокой эффективностью, применяется для обнаружения циркулирующих опухолевых клеток, субклеточных образований, белков, гликопротеинов, нуклеиновых кислот. Однако низкая чувствительность метода не позволяет использовать жидкостную биопсию на начальных стадиях заболевания [5].

Сказанное подтверждает необходимость разработки и внедрения новых, более эффективных и чувствительных методов скрининга КРР, а также оценки прогноза заболевания.

Роль внеклеточных нановезикул в межклеточном взаимодействии

После открытия системы везикулярного транспорта как основной транспортной системы в наших клетках экзосомы стали предметом активного изучения. Экзосомы представляют собой мембранные нановезикулы размером 30–200 нм, содержащие те же липиды, белки, нуклеиновые кислоты и гликопротеины, что и продуцирующие их клетки. Внеклеточные нановезикулы секретируются большинством типов клеток, в том числе клетками опухоли, и присутствуют практически во всех биологических жидкостях – слюне, плазме, сперме, ликворе, секрете бронхов, грудном молоке, моче, амниотической жидкости [6–11].

Состав экзосом обусловлен, с одной стороны, составом предшествующих им эндосом, включающих белки мембраны, белки главного комплекса гистосовместимости, интегрины, тетраспанины, рецепторы, с другой – РНК, ДНК, отдельными белками, поступающими в экзосомы посредством АТФ-зависимого направленного транспорта из клетки-донора.

Все белки в экзосомах можно разделить на две группы – неспецифичные и тканеспецифичные. Неспецифичные белки, например белки теплового шока HSC70, HSP90, тетраспанины, аннексины и флотилины, присутствуют практически во всех экзосомах. Тканеспецифичные белки зависят от принадлежности к тканям, клетки которых выработали ту или иную экзосому, в частности HER-2 для тканей рака молочной железы или МНС II для дендритных клеток и B-лимфоцитов.

Большинство белков экзосом можно также распределить на несколько групп по функциональному назначению: белки цитоскелета, белки комплекса гистосовместимости, белки сигнальной трансдукции, белки слияния и стыковки мембран, белки теплового шока. Чаще в экзосомах встречаются 25 белков, среди которых белок теплового шока 70кДА, СD9, CD 81, CD 63, альбумин, лактатдегидрогеназа А, синтеин, аннексин А5, альдолаза А, кофилин [12].

Секреция экзосом из клетки осуществляется при условии содержания в мембране эндосом церамидов. Только в этом случае возможно слияние с поверхностной мембраной донорской клетки, а не с лизосомой. Кроме того, ГТФазы семейства Rab регулируют выход экзосом во внеклеточное пространство [13, 14]. Установлено, что высокое содержание кальция и низкий уровень рН в межклеточном пространстве усиливают секрецию экзосом [15].

Функции экзосом включают горизонтальный перенос сигнальных молекул, межклеточное взаимодействие посредством передачи белков и РНК с помощью лиганд-рецепторного контакта, встраивания экзосомальной мембраны в клеточную, фагоцитоза экзосом клетками-реципиентами, иммуномодулирующее действие, индукцию ангиогенеза и ремоделирование стромы [16–21].

Экзосомы также имеют высокий терапевтический потенциал: их биомолекулярные особенности позволяют вести фундаментальные и клинические исследования по адресной доставке лекарственных препаратов в клетки-мишени, в том числе преодолевая гематоэнцефалический барьер.

Молекулярные и функциональные особенности экзосомальных микроРНК

Особый научный интерес сосредоточен на экзосомальных микроРНК – коротких одноцепочечных РНК, регулирующих экспрессию генов на посттранскрипционном уровне. По данным литературы, контроль проникновения микроРНК в экзосомы осуществляют белки hnRNPA2B1 и hnRNPA1, а церамид-зависимый механизм обеспечивает доставку экзосомальных микроРНК во внеклеточную среду. Японские исследователи подтвердили основополагающую роль церамид-зависимого механизма путем ингибирования нейтральной сфингомиелиназы II с последующим снижением секреции экзосом и экзосомальных микроРНК во внеклеточную среду [22].

Предметом научных дискуссий остаются способы поглощения клетками-реципиентами экзосом с находящимися в них микроРНК. Рассматриваются такие механизмы, как лиганд-рецепторное взаимодействие, встраивание экзосомальной мембраны в клеточную, фагоцитоз экзосом клетками-реципиентами [23, 24].

Доказана функциональная важность экзосомальных микроРНК при физиологических состояниях. Так, различные экзосомальные микроРНК стимулируют процессы пролиферации и миграции фибробластов, трансляции антигенов в антигенпрезентирующих клетках, регенерации аксонов периферических нервов, индуцируют процессы ангиогенеза, усиливают атеропротективные свойства гладкомышечных клеток [25–30].

Рассматривая патологические состояния, исследователи активно изучают роль экзосомальных микроРНК в возникновении и прогрессировании злокачественных опухолей. Установлено, что экзосомальные микроРНК влияют на рост опухоли, регулируя процессы инвазии, метастазирования и ангиогенеза, а также ее микроокружение посредством активации макрофагов и изменения внеклеточного матрикса [31–35].

Экзосомальные микроРНК – потенциальные биомаркеры колоректального рака

Неинвазивная лабораторная диагностика КРР является перспективной областью исследований. Первые результаты оценки уровня экзосомальных микроРНК представила группа японских ученых под руководством профессора H. Ogata-Kawata в 2014 г. Исследователи показали статистически значимое увеличение уровня семи подтипов микроРНК (miR-1229, miR-23a, let-7a, miR-223, miR-150, miR-1246, miR-21) в плазме крови пациентов с КРР в отличие от здоровых добровольцев [36].

Повышение экзосомальной miR-21 у пациентов с КРР III–IV стадии по сравнению с группой пациентов с I–II стадией подтвердила другая группа японских исследователей. Кроме того, при изучении профиля микроРНК и оценке показателей безрецидивной и общей выживаемости ученые обнаружили зависимость между высоким уровнем miR-21 и снижением продолжительности жизни. В то же время низкий уровень miR-21 коррелировал с увеличением общей выживаемости [37, 38].

В исследовании у 240 пациентов с КРР miR-203 была идентифицирована как прогностически неблагоприятный маркер течения заболевания, коррелировавший со снижением общей и безрецидивной выживаемости [39].

Как продемонстрировал сравнительный анализ диагностической значимости экзосомальных микроРНК у китайских пациентов с КРР in situ, включение в диагностическую панель комбинаций микроРНК увеличивает специфичность метода до 93–94% [40–44].

S. Zhao и соавт. в 2020 г. описали корреляцию высокой экспрессии miR-934 в плазме крови с наличием метастатических очагов КРР, локализующихся преимущественно в печени. Исследователи также охарактеризовали специфические молекулярные особенности miR-934. Молекула, активируя сигнальный путь PI3K/AKT и подавляя экспрессию гена PTEN, индуцирует поляризацию М2-макрофагов, которые способствуют формированию преметастатической ниши для клеток КРР [45]. Кроме того, miR-106b-5p запускает каскад реакций сигнального пути PI3Kγ/AKT/mTOR за счет прямого подавления экспрессии гена программируемой клеточной гибели 4-го типа на пост­транскрипционном уровне, что способствует миграции, инвазии и метастазированию клеток КРР. Высокий уровень экспрессии miR-106b-5p в плазме крови ассоциируется с плохим прогнозом и низкими показателями общей и безрецидивной выживаемости [46].

Другой механизм влияния на развитие метастатических очагов имеет miR-25-3р, регулирующая экспрессию VEGFR-2 в эндотелиальных клетках, что способствует усилению проницаемости сосудов и неоангиогенезу. Так, в исследовании уровня miR-25-3р у 17 пациентов с КРР отмечалось ее резкое снижение на послеоперационном этапе. Исключение составили три пациента, у которых интраоперационно диагностировали метастатическое поражение печени [47].

Помимо диагностики и прогноза течения КРР экзосомальные микроРНК могут использоваться как предикторы ответа на стандартную химиотерапию по схеме FOLFOX. В качестве потенциального биомаркера развития химиорезистентности к оксалиплатину описана miR-208-b в группах химиорезистентных (n = 47) и химиочувствительных (n = 69) пациентов. Биомолекула стимулирует Т-регуляторные лимфоциты, которые в свою очередь тормозят фактор программируемой клеточной гибели 4-го типа, что приводит к росту опухоли и развитию пула химиорезистентных клеток [48]. Напротив, биомаркером химиочувствительности может служить miR-128-3p, способствующая накоплению оксалиплатина в опухолевых клетках и ингибирующая процесс эпителиально-мезенхимального перехода. Доказано, что низкий уровень miR-128-3p ассоциируется с худшим прогнозом у тех, кто получает терапию первой линии по поводу распространенного КРР [49].

Роль miR-93-5p, продуцируемой опухоль-ассоциированными фибробластами, в развитии радиорезистентности клеток КРР подтверждена X. Chen и соавт. (2020). Ученые обнаружили, что miR-93-5р обусловливает уход клеток опухоли от радиационно-индуцированного апоптоза посредством подавления ядерного фактора 3-альфа гепатоцитов и стимуляции трансформирующего фактора роста опухоли бета [50]. Изученные у больных КРР микроРНК представлены в таблице.

Использование микроРНК в качестве потенциального диагностического и прогностического маркера у пациентов с колоректальным раком имеет некоторые ограничения. Из-за отсутствия стандартного метода нормализации микроРНК в биологических средах интерпретация полученных результатов может быть затруднена. Кроме того, использование различных платформ для определения уровня экспрессии микроРНК приводит к низкой воспроизводимости результатов исследований, что требует внедрения точной платформы качественного и количественного профилирования микроРНК [33].

Одним из наиболее часто используемых методов идентификации микроРНК является количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР). Данный метод характеризуется высокой чувствительностью и специфичностью, экономической доступностью, однако ряд исследователей отмечают высокий риск контаминации образцов на этапах амплификации [51].

В ряде случаев альтернативой ОТ-ПЦР может служить нозерн-блот-гибридизация, также относящаяся к количественным методам определения микроРНК. Тем не менее возможности данного метода существенно ограничивает необходимое количество искомой микроРНК в образцах. Не случайно выявление единичных биомолекул весьма затруднено [52].

Постепенно в клиническую практику внедряется высокоспецифичный метод секвенирования нового поколения, который, несмотря на высокую стоимость, способен выявлять даже единичные микроРНК в образцах [53].

Заключение

Экзосомальные микроРНК имеют высокий диагностический и прогностический потенциал, однако для их внедрения в качестве молекулярного маркера в клиническую практику необходима количественная и качественная стандартизация, с учетом которой будет создана точная диагностическая платформа.