Молекулярно-генетический анализ в стратификации риска рака щитовидной железы

Таблица 1. Определение мутации BRAFV600E в гистологических образцах

Таблица 2. Сравнительный анализ экспрессии miRNA в различных гистологических вариантах узловых образований ЩЖ

Таблица 3. Сравнение экспрессии miRNA в группах доброкачественных и злокачественных образований ЩЖ

В последние годы одной из актуальных диагностических проблем в области эндокринологии является определение характера узлов щитовидной железы (ЩЖ) на дооперационном этапе. Согласно данным, при пальпации узловые образования в ЩЖ выявляются лишь у 5–7% взрослого населения [1]. Золотым стандартом предоперационной диагностики узловых образований ЩЖ на сегодняшний день остается тонкоигольная аспирационная биопсия, однако в 20% случаев она не позволяет получить точный цитологический диагноз. Большинство таких пациентов подвергаются хирургическому вмешательству, при этом менее 20% узлов оказываются злокачественными [2]. Именно поэтому продолжается поиск новых дополнительных диагностических маркеров, а также маркеров агрессивности течения рака щитовидной железы (РЩЖ). Одним из перспективных направлений считается исследование уровня экспрессии miRNA. Однако следует отметить, что вопрос о возможности определения профилей экспрессии miRNA для повышения точности диагностики РЩЖ все еще остается открытым. В последние годы опубликованы как положительные [3–6], так и негативные результаты [5] исследований в отношении этой проблемы.

МикроРНК представляют собой малые (19–25 нуклеотидов), некодирующие молекулы РНК, которые обычно функционируют как отрицательные регуляторы экспрессии генов, кодирующих белок [7]. Установлено, что miRNA участвует в развитии нескольких типов опухолей в основном за счет аномальных уровней экспрессии зрелых транскриптов miRNA по сравнению с соответствующими незатронутыми тканями [8]. Показано, что как стимуляция онкогенных miRNA (например, miR155, miR21), так и подавление функционирующих как супрессоры опухолевого роста miRNA (например, miR15a, miR16) способствуют развитию опухолевого процесса [9–12]. H. He и соавт. в 2005 г. получили предварительные доказательства потенциальной роли miRNA при папиллярном раке щитовидной железы (ПРЩЖ) [13]. Исследователи отметили сверхэкспрессию нескольких miRNA в опухолевой ткани по сравнению со здоровой тканью ЩЖ. В список активирующих (до 19,3 раза) miRNA вошли miR146, miR221/222, miR155, miR34 и miR181. Вскоре эти данные были подтверждены в других работах [14]. Исследователи пришли к выводу, что в патогенезе ПРЩЖ участвуют повышенная регуляция нескольких miRNA, измененное ингибирование их мишеней, а также изменение последовательности генов, направленных на miRNA, могут способствовать их регуляции [13, 14]. Различные miRNA дерегулируются при фолликулярном раке ЩЖ (ФРЩЖ) и анапластической карциноме [15, 16]. Это доказывает, что каждый тип РЩЖ имеет специфические признаки экспрессии определенных miRNA.

В ретроспективном исследовании C.K. Chou и соавт. в 2010 г. было показано, что некоторые miRNA (miR-221/222 и miR-146b) связаны с клинически агрессивными видами ПРЩЖ [17]. Однако остается актуальным проведение более крупного проспективного клинического исследования.

Целью нашего исследования стал сравнительный анализ гистологических образцов в группе доброкачественных и злокачественных образований щитовидной железы с помощью молекулярно-генетического тестирования (определение мутации BRAFV660E, экспрессии гена HMGA2, микроРНК (miR, miRNA)) для выявления возможной корреляции данных маркеров с неблагоприятным онкологическим прогнозом.

Материал и методы

В ретроспективное исследование типа «случай – контроль» включены 112 пациентов, прооперированных с подозрением на РЩЖ (цитологическое заключение Bethesda III–VI) в 2018 г. на базе отделения онкологической хирургии № 1 Университетской клинической больницы № 1 Сеченовского Университета.

Всем пациентам проводилось дооперационное цитологическое исследование с интерпретацией результатов по системе Bethesda (2009 г.), ультразвуковое исследование ЩЖ, устанавливался тиреоидный статус. Результаты цитологического исследования, а также клинико-лабораторные данные были сопоставлены с данными гистологического исследования. В качестве прогностических ультразвуковых признаков оценены наличие/отсутствие кальцинатов, неровность/нечеткость контура, гипоэхогенность узлового образования. Окончательный диагноз установлен на основании гистологического заключения. Все образцы цитологического и гистологического исследования верифицированы одним специалистом. РЩЖ классифицирован клинически по системе TNM (Американский объединенный комитет по раку (AJCC), 8-е изд., 2017 г.). По результатам послеоперационного гистологического исследования пациентов разделили на две группы. В первую группу вошли лица со злокачественными образованиями ЩЖ (n = 54), во вторую – с доброкачественными образованиями ЩЖ (n = 58). Из 58 больных у 30 диагностирована фолликулярная аденома, у 28 – коллоидный зоб.

В рамках нашего исследования к признакам агрессивного течения опухоли относили мультицентричность, инвазию в капсулу узла и капсулу щитовидной железы, инвазию в лимфатические сосуды, наличие регионарных или отдаленных метастазов. Отдельно оценивали все известные случаи рецидива – 13% (n = 7).

В ходе дальнейшего исследования на базе Института молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук для всех типов опухолей и образований проведено молекулярно-генетическое тестирование. Из материала гистологических препаратов выделены образцы ДНК и РНК и проанализированы уровни экспрессии гена HMGA2, 12 miRNA (miR144, miR145, miR146, miR155, miR183, miR199, miR221, miR31, miR551, miR375, miR451, miR7) методом реакции обратной транскрипции с последующей полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ). Мутация BRAFV600E с помощью аллель-специфичной ПЦР с гидролизуемым зондом [18].

Уровень относительной экспрессии miRNA рассчитывали с помощью метода 2-ΔCq. Повышенным или пониженным уровнем miRNA в исследуемом образце считали изменение уровня в пять раз или более относительно нормального (контрольного образца) в большую или меньшую сторону.

Исследование проводилось с соблюдением принципов добровольности и конфиденциальности в соответствии с Основами законодательства РФ об охране здоровья граждан (указ Президента РФ от 24.12.1993 № 2288). Проведение исследования было одобрено локальным комитетом по этике Первого МГМУ имени И.М. Сеченова (регистрационный номер 02-17).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием методов параметрического и непараметрического анализа с использованием пакета программ IBM SPSS Statistics 23. Исследованные количественные показатели представляли в виде медианы (Ме). Для сопоставления групп по количественным признакам применяли непараметрические методы: U-критерий Манна – Уитни, критерий Краскала – Уоллиса. Для сравнения частот использовали χ² и точный критерий Фишера. Оптимальные уровни показателей чувствительности и специфичности определяли методом наибольшей суммы. Различие между группами считали статистически достоверным при р < 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

На дооперационном этапе неопределенный цитологический диагноз (Bethesda III и IV) имели 40,7% пациентов, Bethesda V – 25,9%. По результатам гистологического исследования в первой группе выявлено 47 случаев ПРЩЖ, три случая ФРЩЖ, два – медуллярного РЩЖ (МРЩЖ) и два случая анапластического РЩЖ (АРЩЖ). Средний возраст пациентов составил 51,3 [19–79] года. В данной группе статистически значимо преобладали женщины – 85,15%. Средний объем ЩЖ составил 33,0 [6,1–156,0] мл. Большинство (68,5%) пациентов имели узлы более 1 см. В трети случаев это были микрокарциномы.

Выбор объема операции был обусловлен результатами цитологического исследования, наличием или отсутствием признаков метастатического поражения регионарных лимфоузлов, а также размерами и количеством узлов. В 70,3% случаев оперативное лечение выполнено в объеме тиреоидэктомии, в том числе в 42,6% с лимфодиссекцией, в 29,6% случаев – гемитиреоидэктомии. В первой группе с помощью TNM установлено, что большинство пациентов имели РЩЖ на стадии Т1 (n = 28) или Т2 (n = 4). У оставшихся пациентов (n = 22) диагностированы стадии Т3 и Т4. Гистологически агрессивные характеристики имели 50,7% опухолей. У семи (13,7%) пациентов обнаружена инвазия в капсулу узла, у троих (5,8%) – инвазия в лимфатические сосуды, у восьми (15,6%) отмечалась мультицентричность. Еще у восьми (15,6%) опухоль прорастала в капсулу ЩЖ. Метастатическое поражение регионарных лимфоузлов отмечалось у 20 (38,9%) пациентов. У 34 (61,1%) больных не было выявлено данных о метастатическом процессе. Отдаленные метастазы обнаружены у пациента с АРЩЖ.

Нами проведен молекулярно-генетический анализ 112 образцов послеоперационного гистологического исследования на наличие мутации BRAFV600E, а также корреляционный анализ BRAFV600E с морфологическими характеристиками опухоли и клинико-анамнестическими данными пациентов (табл. 1).

Мутация BRAFV600E в 68% случаев определялась лишь в группе с гистологическим диагнозом «папиллярная карцинома». При других гистологических вариантах РЩЖ таковая не выявлена.

Достоверной связи между метастатическим поражением лимфоузлов, а также гистологическими агрессивными характеристиками опухоли и статусом BRAFV600E в нашем исследовании не установлено.

Анализ зависимости BRAF-положительного статуса от пола пациентов показал, что таковая присутствовала у семи (87,5%) из восьми мужчин, у 25 (78,1%) из 32 женщин (р < 0,05). Данных о связи BRAF-положительных опухолей с возрастом пациентов в ходе исследования не получено.

BRAF-положительный статус определялся в 80% случаев при микрокарциномах и в 52,6% – при опухолях более 1 см. У шести (50%) из 12 пациентов с микрокарциномами имела место инвазия в капсулу узла ЩЖ, у пяти (41,6%) опухоль не выходила за пределы капсулы, у трех (25%) – мульти­центричное распространение опухоли, инвазия в капсулу ЩЖ – у двух (16,6%) пациентов, у одного (8,3%) зафиксированы метастазы в регионарные лимфоузлы и лишь у одного (8,3%) больного – инвазия в лимфатические сосуды.

Таким образом, полученные данные еще раз подтверждают, что размер узлового образования не всегда коррелирует со сте­пенью агрессивности РЩЖ и только по размеру узлового образования невозможно принимать решение об объеме оперативного вмешательства.

Результаты по частоте выявления BRAFV660E-мутации при ПРЩЖ соответствуют данным других исследователей. Так, в исследовании М.А. Быкова, проведенном в 2015 г., частота определения BRAF600E-мутации при ПРЩЖ составила 59,4% [19]. Автором также была показана достоверная связь данной мутации с агрессивными характеристиками опухоли. Однако это не соответствует нашим результатам. В других исследованиях также получены противоречивые данные о корреляции BRAF-мутации с агрессивными характеристиками опухоли [20, 21].

В исследуемых образцах первой группы проведен сравнительный анализ экспрессии 12 микроРНК, а также ультразвуковых и клинических характеристик узловых образований. При опухолях с таким ультразвуковым признаком, как нечеткость/неровность контуров, с достоверно большей частотой определялась экспрессия гена HMGA2 (р = 0,01) и повышенная экспрессия miR31 (p = 0,02). Гипоэхогенная структура была связана с пониженной экспрессией miR144 (p = 0,01) и miR155 (p = 0,006). В случае метастатического поражения регионарных лимфатических узлов с высокой достоверностью отмечалась пониженная экспрессия miR7 (р = 0,0001) по сравнении с опухолями без экстратиреоидного распространения. В случае рецидивирующего течения также определяли пониженную экспрессию miR7 (р = 0,003).

HMGA2 выявляли достоверно с более высокой частотой у мужчин (р = 0,008), экспрессия трех miRNA, miR146, miR221 и miR551 у них также была выше (р = 0,001, р = 0,03, р = 0,02). Корреляция с возрастом прослеживалась в отношении экспрессии miR221 и miR451. У пациентов 45 лет и старше отмечалась повышенная экспрессия miR221 (р = 0,035) и достоверно сниженная – miR451 (р = 0,017).

При распределении образцов по гистологическим вариантам в нашем исследовании были определены онкогенные и онкосупрессорные miRNA для каждого из гистологических диагнозов. Нами установлены онкогены ПРЩЖ – miR31, miR155, miR551, miR146, ФРЩЖ – miR183, МРЩЖ – miR7 и miR375. В случае узлового коллоидного зоба (УКЗ) с высокой достоверностью отмечалась повышенная экспрессия онкосупрессорных miR199, miR145 и miR7, фолликулярной аденомы (ФА) – повышенный уровень экспрессии miR145 и miR7 (табл. 2). Расчет осуществляли с использованием теста Манна – Уитни. Уровень статистической значимости различий между группами составил менее 0,05.

По результатам сравнительного анализа в группе злокачественных образований выявлены статистически значимые различия по уровню экспрессии онкогенных miR146, miR221, miR155, miR375, miR31, miR551 и онкосупрессорных miR7 и miR145 (p = 0,0001) по сравнению с группой доброкачественных образований ЩЖ (табл. 3). При расчете использовали тест Манна – Уитни. Уровень статистической значимости различий между группами составил менее 0,05.

Вывод

Проведенное нами исследование позволило оценить возможность использования молекулярно-генетических маркеров в дифференциальной диагностике доброкачественных и злокачественных образований ЩЖ. Исследованные нами маркеры применимы также для цитологического материала, полученного методом тонкоигольной аспирационной биопсии, и могут применяться в клинической практике. Совершенствование методов дооперационной диагностики РЩЖ должно способствовать выбору оптимального объема оперативного лечения, уменьшению количества диагностических и повторных операций. 

Конфликт интересов

Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов в отношении данной публикации.

Финансирование

Авторы заявляют об отсутствии финансовой поддержки в отношении данной публикации.