Введение

Частота встречаемости бактериального вагиноза (БВ) варьирует в зависимости от популяции: среди пациенток репродуктивного возраста она составляет 5–59%, среди беременных – 13–31% [1]. При наличии влагалищных выделений БВ выявляется в 80–87% случаев, а у беременных – в 37–40% [2]. Жалобы на выделения, зуд или жжение предъявляют 50% беременных [3].

Дисбиоз влагалища повышает риск инфекций, передаваемых половым путем, а также в 40% случаев служит предиктором преждевременных родов [4]. На фоне дисбиоза в 70% наблюдений возрастает количество Escherichia coli и Klebsiella spp., в 30% – Staphylococcus aureus и Streptococcus agalactiae. Частота рецидивов БВ достигает 50–67%. О рецидиве говорят, если за год зарегистрировано три эпизода заболевания, а жалобы возобновляются в течение трех месяцев после завершения терапии [5].

Рецидивирующее течение вагинита сопровождается повышением концентрации Enterococcus и St. agalactiae, что приводит к развитию воспаления. Дисбиотический процесс характеризуется снижением уровня лактобактерий и ростом числа анаэробных бактерий – Gardnerella vaginalis, Atopobium vaginae, Prevotella, Megasphaera, Sneathia, которые участвуют в образовании биопленок, способствуя переходу заболевания в рецидивирующую форму. При хронической форме преобладают анаэробы, при вагините – аэробы. Повторная терапия вагинита антибиотиками подавляет количество лактобацилл и увеличивает титры патогенов, что способствует трансформации вагинита в БВ. Именно поэтому рецидивирующее течение трудно поддается лечению [6].

Актуальность проблемы обусловлена широкой распространенностью БВ и ростом частоты рецидивов после терапии у пациенток репродуктивного возраста [7].

Формирование биопленочного процесса при бактериальном вагинозе

Большинство бактерий формируют биопленки на слизистых оболочках и искусственных поверхностях, что в дальнейшем снижает эффективность лечения. В связи с этим в настоящее время особое внимание уделяется исследованию препаратов, подавляющих биопленки [8]. БВ сегодня можно рассматривать как биопленочный процесс, при котором микроорганизмы находятся на слизистой оболочке влагалища, связаны между собой и окружены матриксом [9, 10]. Внеклеточный матрикс биопленок состоит из полисахаридов, нуклеиновых кислот и белков [8–13]. В зарубежном исследовании показано, что во внеклеточном матриксе биопленок концентрация внеклеточной ДНК составляет 10,6%, полисахаридов – 22,4%, белков – 54,7%. Таким образом, матрикс биопленок более чем на 50% состоит из белков [12].

Важным признаком БВ является формирование под влиянием G. vaginalis биопленок на влагалищном эпителии [11, 14–17]; к этим биопленкам впоследствии прикрепляются другие БВ-ассоциированные бактерии. Частота выявления G. vaginalis достигает 95–100% [14, 15, 18, 19]. Микроорганизм обладает следующими свойствами: цитотоксичностью, способностью к адгезии на эпителии влагалища и образованию биопленок [11]. G. vaginalis и A. vaginae являются основными представителями биопленок, оказывают значительное влияние на местный иммунитет влагалища и служат маркерами БВ [18]. В исследовании продемонстрировано, что главные бактерии, способствующие развитию БВ и участвующие в формировании биопленки, – G. vaginalis, Prevotella bivia и Fannyhessea vaginae. G. vaginalis продуцирует аминокислоты, P. bivia – аммиак, который стимулирует рост G. vaginalis и в дальнейшем способствует развитию полимикробной биопленки [13].

Биопленка представляет собой сообщество микробов на поверхности эпителия влагалища. Эти микроорганизмы продуцируют матрикс, выполняющий функцию защиты от воздействия факторов хозяина. Биопленки обеспечивают выживание микроорганизмов, препятствуя проникновению антибактериальных препаратов и подавляя их действие [11]. Биопленка, которой свойственны вирулентность, цитотоксичность и способность прикрепляться к эпителию влагалища, поддерживает жизнеспособность G. vaginalis во влагалище. G. vaginalis характеризуется факторами патогенности: ваголизином и сиалидазой. Ваголизин способствует разрушению клеток эпителия влагалища, сиалидаза подавляет защитную функцию слизистой оболочки благодаря воздействию на сиаловую кислоту, что облегчает прикрепление бактерий к эпителию [20].

Формирование биопленок представляет собой процесс взаимодействия между бактериями и клетками хозяина, который регулируется несколькими механизмами и включает такие этапы, как прикрепление к эпителию влагалища, адгезия и адаптация бактерий, их закрепление на поверхности, формирование микроколоний, созревание и дисперсия [12]. Преимущественное присутствие в биопленке G. vaginalis влияет на эпителий влагалища, снижает вязкость вагинальных выделений, нарушает слизистый барьер и способствует распространению инфекций в верхние отделы урогенитального тракта [21]. Показано, что G. vaginalis находится во влагалище в двух формах: связанной и одиночной. Связанная форма встречается в больших количествах у пациенток с установленным диагнозом БВ. Одиночная форма наблюдается у здоровых женщин и мужчин, что указывает на половой путь передачи. Микроорганизмы внутри биопленок способствуют подавлению метаболизма и синтеза белка, что в дальнейшем приводит к снижению обмена веществ и делению клеток, обусловливая высокую устойчивость к антибактериальным препаратам [22].

Методы исследования биопленок при бактериальном вагинозе

В настоящее время для диагностики БВ используются критерии Амселя, шкала Ньюджента, полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени и секвенирование NGS. Золотым стандартом диагностики считаются критерии Амселя (обнаружение трех-четырех признаков): выделения из половых путей, неприятный рыбный запах, повышение pH > 4,5, наличие ключевых клеток. Оценка по шкале Ньюджента позволяет определить морфотипы бактерий с помощью микроскопии. Подсчет баллов: 0–3 балла – нет БВ, 4–6 баллов – нет признаков БВ, 7–10 баллов – признаки БВ [17, 21–23]. Существуют и другие методы диагностики. Критерии Хэя – Айсон включают определение морфотипов бактерий: 0 – без бактерий, 1 – нет БВ, 2 – нет признаков БВ, 3 – признаки БВ, 4 – кокки [21, 22, 24]. Критерии А.М. Савичевой и соавт. также основаны на микроскопии мазка: соотношение лейкоцитов и эпителиальных клеток 1:1, наличие ключевых клеток, присутствие морфотипа лактобактерий или его отсутствие [22].

При БВ используются молекулярно-генетические тесты: флуоресцентная гибридизация in situ (fluorescent in situ hybridization, FISH), секвенирование гена 16S рРНК, ПЦР-исследование в режиме реального времени. FISH позволяет визуализировать микробные сообщества и выявлять определенные виды микроорганизмов [22, 23]. В настоящее время метод FISH применяется для обнаружения биопленок на влагалищном эпителии у пациенток с БВ [23].

По мнению А. Свидзинского и С. Свидзинской, ПЦР в режиме реального времени и секвенирование позволяют визуализировать в вагинальных мазках наличие более 500 видов бактерий. Выявленные микроорганизмы встречаются как у практически здоровых, так и у больных пациенток, поэтому постановка окончательного диагноза только на основании наличия или отсутствия тех или иных бактерий невозможна. Авторы связывают это с полимикробной природой заболевания и участием нескольких микробов в его развитии [23, 24].

В исследовании показано, что при ПЦР в режиме реального времени повышенная бактериальная нагрузка (> 10⁶ ГЭ/мл) G. vaginalis (p < 0,001) и A. vaginae (p < 0,001) обусловлена присутствием биопленок. Оба микроорганизма, присутствующие во влагалище, являются главными компонентами биопленок, однако наличие только A. vaginae не способствует формированию биопленки. По мнению авторов исследования, G. vaginalis в высоком титре служит основным возбудителем, инициирующим образование биопленок. На рисунке 1 представлена полимикробная биопленка, окрашенная DAPI и визуализированная с помощью флуоресцентной микроскопии [14].

В указанном исследовании ни в одном влагалищном образце не было выявлено A. vaginae в отсутствие G. vaginalis. Согласно результатам флуоресцентной гибридизации in situ, в половине образцов, содержавших G. vaginalis, A. vaginae отсутствовал. Микроорганизмы находились как в одиночном, так и в связанном состоянии. В одиночном состоянии A. vaginae не вызывает образования биопленок. Биопленка формируется только тогда, когда A. vaginae является ее частью и вместе с G. vaginalis присутствует во влагалище в повышенной концентрации [14].

По мнению К.А. Россоловской и соавт., трансмиссионная электронная микроскопия (ТЭМ) позволяет выявлять биопленки у пациенток с рецидивирующим БВ. Этот метод визуализирует скопления бактерий, плотно прилегающих друг к другу, соединенных между собой и покрытых внеклеточным матриксом. ТЭМ также дает возможность определить структуру биопленок микроорганизмов [9].

К. Гашпар и соавт. продемонстрировали визуализацию биопленок при БВ с помощью электронной микроскопии и показали эффективное разрушение их структуры после применения деквалиния хлорида [8]. На рисунке 2 представлена визуализация биопленки G. vaginalis с помощью электронной микроскопии [8].

В настоящее время FISH используется не только для определения и обнаружения биопленок при БВ, но и для идентификации видов бактерий в полимикробной среде [24].

Заключение

Диагностика биопленок при БВ с помощью FISH, конфокальной микроскопии или ТЭМ целесообразна в практическом аспекте и позволяет визуализировать биопленку при рецидивирующей форме заболевания. Однако из-за высоких материальных затрат данные методы используются преимущественно в научных целях и только в специализированных научных институтах. 

Финансирование. Работа выполнена без финансовой поддержки.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

New Approaches to Biofilm Research in Bacterial Vaginosis  

N.Z. Mammaeva, E.I. Manukhina, PhD, Prof., T.P. Zakharova, PhD   

Russian University of Medicine 

Contact person: Naina Z. Mammaeva, letuchka92@mail.ru  

Bacterial vaginosis is a disorder of the vaginal microflora that negatively affects the quality of life of patients of reproductive age. The disease is characterized by the formation of biofilms, stable associations of microorganisms interconnected. Biofilms often cause chronic and recurrent infections, as well as reduce the effectiveness of antibacterial therapy. One of the methods for visualizing biofilms in the vagina in patients with bacterial vaginosis is in situ fluorescent hybridization.