Адъювантная терапия лигнаном 7-гидроксиматаирезинолом как метод повышения онкологической безопасности приема эстрогенов

Таблица 1. Динамика массы тела мышей в экспериментальных группах

Рис. 1. Стандартное отклонение массы тела при приеме 7-HMR в дозах 60 мг/кг/сут (А) и 120 мг/кг/сут (Б)

Рис. 2. Динамика роста объема опухолевого узла: А – 7-HMR 60 мг/кг/сут, индивидуальные кривые; Б – 7-HMR 60 мг/кг/сут, усредненные кривые; В – 7-HMR 120 мг/кг/сут, индивидуальные кривые; Г – 7-HMR 120 мг/кг/сут, усредненные кривые

Рис. 3. Динамика роста среднего объема опухолевого узла при приеме 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут: тест Колмогорова – Смирнова на седьмые (А), 13-е (Б), 17-е (В), 21-е (Г) сутки

Рис. 4. Динамика роста среднего объема опухолевого узла на фоне приема эстрадиола валерата (0,51 мг/кг/сут)

Таблица 2. Средняя продолжительность жизни животных и статистические показатели

Введение

Лигнан 7-гидроксиматаирезинол (7-hydroxymatairesinol – 7-HMR), получаемый из сучков ели европейской (Picea abies), проявляет антиоксидантные, противовоспалительные, противомикробные и противоопухолевые свойства. Систематический анализ исследований указал на высокую биоусвояемость (более 50%) и низкую токсичность молекулы 7-HMR. Установлены противовоспалительные свойства 7-HMR, обусловленные ингибированием белка NF-κB (опосредующего провоспалительные эффекты цитокина фактора некроза опухоли альфа) и повышением экспрессии ферментов антиоксидантной защиты (супероксиддисмутазы, гемоксигеназы 1) [1].

В частности, особый интерес представляют противоопухолевые эффекты 7-HMR. Показано, что 7-HMR ингибирует рост гепатомы, опухолей молочной железы, матки, предстательной железы и толстого кишечника [1]. Хемореактомные оценки свойств 7-HMR позволили сформулировать молекулярные механизмы противоопухолевых эффектов молекулы (антиоксидантный эффект за счет ингибирования гемоксигеназ, циклинзависимых киназ 3 и 4, фактора роста эпидермиса и белка mTOR) [2].

В настоящей статье представлены результаты исследования влияния 7-HMR (Лигнариус) в дозах 60 и 120 мг/кг/сут на интенсивность роста злокачественной опухоли (солидной карциномы Эрлиха) – одной из стандартных моделей изучения противоопухолевых свойств веществ. Данная опухоль представляет собой спонтанный рак молочной железы у самок мышей [3].

Материал и методы

Лабораторные животные. Исследования проведены на 74 аут­бредных мышах-самках. Животные были получены из питомника Научного центра биомедицинских технологий ФМБА России, имели ветеринарный сертификат и прошли 20-суточный карантин в виварии Медицинского радиологического научного центра им. А.Ф. Цыба. Животные содержались в соответствии с требованиями приказа МЗ РФ № 708н: в клетках Т-3 в условиях естественного освещения и принудительной 16-кратной вентиляции, при температуре 18–20 °C и относительной влажности воздуха 40–70%, на подстилке из простерилизованных древесных стружек, со свободным доступом к питьевой воде и стандартному брикетированному корму ПК-120-1 (ООО «Лабораторснаб», РФ). Все работы с лабораторными животными выполнены в соответствии с общепринятыми этическими нормами, на основе стандартных операционных процедур, которые приняты в Медицинском радиологическом научном центре им. А.Ф. Цыба и отвечают правилам Европейской конвенции по защите животных, используемых для научных целей (ETS 123).

Опухолевая модель. Исследования проведены на перевиваемой мышиной карциноме Эрлиха. Штамм поддерживался на аутбредных мышах-самках в виде асцитной карциномы. Трансплантацию солидной карциномы Эрлиха аутбредным мышам-самкам проводили подкожным введением 2,5 × 10⁶ опухолевых клеток в 0,1 мл суспензии в область латеральной поверхности правого бедра, на которой предварительно депилировали шерст­ный покров.

Экспериментальные группы, способ введения и дозы препаратов. После трансплантации карциномы Эрлиха мышей-опухоленосителей распределили методом рандомизации в пять экспериментальных групп – одну контрольную и четыре подопытных, по 14–16 особей в каждой. Животных включали в опыт на пятые сутки после перевивки карциномы Эрлиха, когда опухолевый узел уже сформировался и достиг измеряемого размера практически у всех мышей.

Животные контрольной группы в дальнейшем не получали никаких воздействий. Животным первой опытной группы с седьмых по 21-е сутки роста солидной карциномы Эрлиха ежедневно однократно внутрижелудочно (в/ж) вводили 7-HMR в дозе 60 мг/кг/сут. Особям второй подопытной группы с седьмых по 21-е сутки роста опухоли ежедневно однократно в/ж вводили 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут. Животным третьей подопытной группы на пятые и шестые сутки роста карциномы Эрлиха однократно в/ж вводили эстрадиола валерат (0,51 мг/кг/сут) и далее с седьмых по 21-е сутки роста опухоли ежедневно в/ж вводили эстрадиола валерат и через 30 минут 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут. Животным четвертой подопытной группы с седьмых по 21-е сутки роста опухоли ежедневно однократно в/ж вводили эстрадиола валерат в дозе 0,51 мг/кг/сут. Рабочие растворы препаратов изготавливались непосредственно перед введением на 1%-ном крахмальном геле в концентрациях из расчета 0,1 мл на 10 г массы тела животных. Растворы эстрадиола валерата готовили с добавлением TWIN 80.

Оценка эффектов. Переносимость изучаемых препаратов оценивали по реакции животных на их введение и путем ежедневного осмотра и наблюдения за животными, в котором изучался неврологический статус по характеру спонтанной двигательной активности, общей возбудимости и реакции на тактильные и звуковые раздражители, а также по пищевой активности животных и динамике прироста их массы тела.

Влияние препаратов на опухолевый процесс изучали по динамике роста солидной карциномы Эрлиха. Для этого каждые три-четыре дня у всех животных измеряли калипером максимальный (L) и минимальный (W) диаметр опухолевых узлов и оценивали их объем в приближении V = (L × W²) × (π/6), которое надежно коррелирует с данными магнитно-резонансной томографии. Влияние на развитие карциномы Эрлиха оценивали путем статистического сравнения объема опухолевых узлов в контрольной и подопытных группах на различных сроках наблюдения, а также путем статистического сравнения диаграмм выживаемости Каплана – Мейера и средней продолжительности жизни животных.

Статистическая обработка. Статистическую оценку значимости межгрупповых различий объемов опухолевых узлов карциномы Эрлиха выполняли с использованием универсального метода непараметрической статистики – критерия Колмогорова – Смирнова. Статистическое сравнение диаграмм выживаемости проводили по F-критерию Кокса. Расчеты выполнены с помощью программного пакета Statistica 7.0 (StatSoft Inc., США).

Результаты и их обсуждение

Раздельное и комбинированное субхроническое в/ж введение растворов 7-HMR и эстрадиола валерата в использованных дозах животные переносили легко. Каких-либо проявлений интоксикации, изменений в поведении и двигательной активности подопытных мышей не наблюдалось. В течение всего эксперимента пищевая активность в подопытных группах не отличалась от пищевой активности контрольных животных. Масса тела животных в подопытных группах колебалась в пределах погрешности и статистически не отличалась от массы тела животных в контрольной группе (табл. 1).

В данной работе было проведено две серии экспериментов. В первой серии оценивалось влияние двух различных доз 7-HMR (60 и 120 мг/кг/сут) на интенсивность роста опухоли и выживаемость животных. Во второй серии изучалось воздействие 7-HMR на рост опухоли на фоне приема эстрадиола валерата.

Противоопухолевое действие 7-гидроксиматаирезинола

В то время как достоверных различий в динамике массы тела среди опытных и контрольных животных не наблюдалось (см. табл. 1), было установлено достоверное увеличение значений стандартного отклонения массы тела на фоне введения 7-HMR (рис. 1). Иначе говоря, у одних животных рост массы тела замедлялся, у других – ускорялся. Такой дифференцированный отклик косвенно свидетельствовал о противоопухолевом действии препарата.

Согласно анализу динамики роста среднего объема опухолевого узла, применение 7-HMR тормозило интенсивность роста опухолей (рис. 2). Наиболее выраженный эффект отмечался при использовании 120 мг/кг/сут 7-HMR.

Анализ данных, проведенный с использованием теста Колмогорова – Смирнова, показал, что при введении 7-HMR в дозе в 60 мг/кг/сут достоверные различия в среднем объеме опухолей наблюдались только на 21-е сутки (см. рис. 2). Так, средний объем опухоли в группе 7-HMR 60 мг/кг/сут   снижался на 407 мм³, что было достоверно ниже, чем в группе контроля (максимальное уклонение D = 0,39, число точек сравнения n = 11, p = 0,051).

При повышении дозы 7-HMR противоопухолевый эффект был более очевиден. Так, на фоне введения 7-HMR 120 мг/кг/сут средний объем опухоли был достоверно ниже, чем в группе контроля, уже на седьмые сутки. В дальнейшем разница между опытной и контрольной группами нарастала и была статистически достоверной на 13, 17 и 21-е сутки (рис. 3). Например, на 21-е сутки средний объем опухолевого узла в основной группе был на 620 мм³ меньше такового в группе контроля (максимальное уклонение D = 0,59, n = 11, p = 0,00036, см. рис. 3). Более того, на 21-е сутки ни у одного из животных, получавших 120 мг/кг/сут 7-HMR, не наблюдались значения объема опухоли более 1100 мм³, в то время как в группе контроля такие значения отмечались у половины животных (50%, n = 7).

Противоопухолевое действие 7-гидроксиматаирезинола на фоне приема эстрогенов

Прием эстрогенсодержащего препарата после создания опухоли приводил к некоторому увеличению интенсивности роста опухолевых узлов (рис. 4А, Б). Однако наблюдаемые различия не были достоверными (p > 0,25). 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут достоверно тормозил интенсивность роста опухолевых узлов на фоне введения эстрогенов (рис. 4В, Г). Различия были статистически достоверными на 10, 13, 17 и 21-е сутки. Наиболее выраженным был эффект на 21-е сутки: средний объем опухолевого узла уменьшился на 322 мм³, что достоверно ниже, чем в группе животных, получавших только эстрадиола валерат (D = 0,43, p = 0,007).

Анализ выживаемости животных при приеме 7-гидроксиматаирезинола

При анализе выживаемости животных обращало на себя внимание то, что у единичных (одной-двух) мышей в группах, получавших 7-HMR, отмечалось существенное увеличение продолжительности жизни, хотя при статистическом анализе эти эффекты оставались в пределах статистической погрешности (табл. 2). Две из 14 мышей, получавших 120 мг/кг/сут 7-HMR, и одна из 14 мышей, получавших 60 мг/кг/сут 7-HMR, были живы после трех с половиной месяцев от начала эксперимента. В контрольной группе к 60-му дню эксперимента все животные погибли. Таким образом, прием 7-HMR создавал прецеденты необычно продолжительного выживания животных в условиях роста солидной карциномы Эрлиха и, как было показано выше, существенно снижал интенсивность роста опухолей.

Результаты настоящей работы подтверждают противоопухолевые свойства 7-HMR и указывают на достоверное ингибирование роста опухолей модели рака молочной железы (солидная карцинома Эрлиха). Ранее было показано, что 7-HMR ингибирует рост модели опухоли молочной железы, индуцированной 7,12-диметилбензантраценом [4, 5]. При этом 7-HMR уменьшал образование полипов и предотвращал накопление бета-катенина в ядре (патофизиологическая метка образования полипов) [6].

В эксперименте 7-HMR и его метаболит энтеролактон уменьшают рост и метастазы клеток опухоли печени, привитых подкожно крысам (клеток гепатомы линии AH109A). 7-HMR подавлял пролиферацию клеток гепатомы, удлиняя время деления клеток гепатомы и увеличивая скорость апоптоза раковых клеток [7].

Показано, что 7-HMR позволяет осуществлять эффективную профилактику опухолей матки, вызванных однократным воздействием канцерогена N-этил-N'-нитро-N-нитрозогуанидина на крыс в 11-недельном возрасте. После воздействия канцерогена осуществлялись дотации весьма больших доз 7-HMR (200 или 600 мг/кг/сут в составе соевой диеты) до возраста 15 месяцев. Заболеваемость аденокарциномой матки была значительно снижена уже при приеме 200 мг/кг/сут 7-HMR (11%, контрольная группа – 50%, р < 0,05) [8].

Химиопрофилактическая активность 7-HMR также была показана на модели аденоматозной полипозной кишечной неоплазии у мышей. Среднее число аденом в тонком кишечнике при приеме 7-HMR было значительно ниже (26,6 ± 11,0, р < 0,05) по сравнению с плацебо (39,6 ± 8,9). Введение 7-HMR приводило к нормализации уровня бета-катенина в ткани аденомы, что указывает на то, что 7-HMR опосредует химиопрофилактический эффект через бета-катениновый сигнальный путь. Заметим, что использование 7-HMR позволило восстановить внутриядерный уровень бета-катенина в ткани аденомы (0,41 ± 0,25 у.е.) до уровня, обнаруженного в неизмененных клетках окружающей слизистой оболочки (0,36 ± 0,28 у.е.) [9].

Выводы

В работе иследовано влияние 7-HMR в дозах 60 и 120 мг/кг/сут на скорость роста опухолевых узлов солидной карциномы Эрлиха. Наиболее выраженный эффект отмечался при использовании 120 мг/кг/сут 7-HMR: на 21-е сутки средний объем опухоли достоверно снижался на 620 мм³ (разница с группой контроля достоверна, p = 0,00036 по тесту Колмогорова – Смирнова). Ни у одного из животных на фоне введения 120 мг/кг/сут 7-HMR не наблюдались значения объема опухоли более 1100 мм³, в то время как в группе контроля такие значения отмечались у 50% животных. 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут достоверно тормозил интенсивность роста опухолевых узлов на фоне введения эстрадиола валерата: средний объем опухолевого узла на 21-е сутки снижался на 322 мм³ (p = 0,007). При анализе выживаемости у малой части подопытных мышей-опухоленосителей, получавших 7-HMR в дозе 120 мг/кг/сут (14%), наблюдалось значительное увеличение продолжительности жизни (более трех месяцев). Таким образом, 7-HMR в дозах 60 и 120 мг/кг/сут оказывает достоверное противоопухолевое воздействие на рост солидной карциномы Эрлиха.