Биоинформационный анализ молекулярно-генетических процессов при взаимодействии В1- и гамма-дельта-Т-лимфоцитов

Рис. 1. Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути для В1-клеток

Рис. 2. Карта экспрессионных мишеней канонического сигнального пути для гамма-дельта-Т-лимфоцитов

Введение

В1-клетки – отдельная субпопуляция B-лимфоцитов в организме человека и мышей.

В отличие от B2-клеток, представленных преимущественно в селезенке, лимфоузлах и костном мозге, В1-лимфоциты локализуются в серозных полостях (перитонеальной и брюшной), а также в лимфоидной ткани слизистых оболочек, в частности в слизистой оболочке кишечника.

В онтогенезе В1-клетки появляются раньше В2-лимфоцитов. Предшественники В1-клеток мигрируют из фетальной печени в серозные полости. Считается, что они могут сохраняться в течение всей жизни. Это подтверждается зародышевой организацией генов иммуноглобулинов (Ig) В1-клеток. Однако получены данные о том, что по крайней мере часть В1-клеток взрослого организма может образовываться в костном мозге.

В1-лимфоциты отвечают преимущественно на Т-независимые (ТН) антигены 1-го и 2-го типов.

ТН-1-агенты в достаточно высоких концентрациях способны индуцировать поликлональную активацию B-лимфоцитов (зрелых и незрелых) и продукцию Ig. Классическим примером ТН-1-антигена служит липополисахарид.

ТН-2-агенты имеют преимущественно небелковую природу, большой размер молекул и регулярно повторяющиеся эпитопы, вследствие чего способны вызывать кластеризацию иммуноглобулиновых рецепторов на поверхности В-клеток. В результате формирующийся сигнал достигает силы, достаточной для активации лимфоцита, и второго сигнала от Т-клетки не требуется (это определяет Т-независимость ответа). ТН-2-агенты в отличие от ТН-1-агентов способны активировать В-клетки только специфически, поэтому на них отвечают преимущественно B1-лимфоциты, способные к ТН-ответу [1].

IgA – основной изотип иммуноглобулинов в слизистых оболочках, играющий ключевую роль в нормальном функционировании организма. В частности, IgA препятствует проникновению патогенов в организм через слизистые оболочки. S. Wolbank и соавт. установили, что антитела 2F5IgA, 2F5IgM и 2G12IgM эффективно ингибируют первые стадии проникновения ВИЧ через слизистые оболочки [2].

Большая часть IgA вырабатывается в слизистой оболочке кишечника, преимущественно B1-клетками. Образование В1-лимфоцитами IgA в тонкой кишке свидетельствует о том, что в ТН-В1-клетках происходит переключение изотипа с IgM на изотип IgA [3]. При ответе на Т-зависимые (ТЗ) антигены для переключения изотипов В2-лимфоцит должен получить второй сигнал от Т-клетки. Чем в отсутствие классической помощи Т-клеток обеспечивается переключение классов иммуноглобулинов в В1-клетках и как оно осуществляется, в настоящее время не известно. Предполагается, что в этом процессе могут участвовать гамма-дельта-Т-клетки [4–6].

Гамма-дельта-Т-лимфоциты стали активно изучаться недавно. На данный момент выявлена их способность распознавать некоторые антигены и выступать в роли антигенпрезентирующих клеток (АПК). Кроме того, они обладают цитотоксическими свойствами, поэтому рассматриваются как потенциальные терапевтические мишени [7].

Гамма-дельта-Т-лимфоциты, так же как B1-лимфоциты, образуются в онтогенезе раньше других Т-лимфоцитов. Они локализуются преимущественно на коже и слизистых оболочках, в том числе в лимфоидной ткани, ассоциирующейся со слизистой оболочкой кишечника.

Недостаточность популяции интраэпителиальных гамма-дельта-Т-клеток может обусловить развитие некротических энтероколитов [8], что свидетельствует о регуляторных свойствах этих клеток.

Способность гамма-дельта-Т-клеток влиять на образование антител В1-клетками прямой экспериментальной проверке не подвергалась, и вопрос об их роли в переключении синтеза с IgM на IgA в В1-клетках кишечника по-прежнему остается открытым. Однако имеется достаточное количество сообщений о влиянии некоторых субпопуляций гамма-дельта-Т-клеток на уровень нормальных иммуноглобулинов в организме [9].

Изучение особенностей переключения на IgA B1-клеток кишечника позволит разработать новые терапевтические подходы к лечению заболеваний кишечника инфекционной и неинфекционной природы. Учитывая высокую затратность экспериментальных исследований, представлялось необходимым сузить круг задач и использовать биоинформационные методы анализа.

Целью данной работы стало проведение биоинформационного анализа для выявления возможных путей взаимодействия B1-лимфоцитов с гамма-дельта-Т-клетками, которые могут иметь отношение к гуморальному иммунному ответу на ТН-2-агенты, а также роли малых РНК (miRNA) в продукции антител, активации и пролиферации B1-клеток.

Материал и методы

В биоинформационном исследовании использована программа Pathway Studio® и реферативная база данных ResNet® компании Ariadne Genomics (США).

Объектами изучения стали аннотации биологических объектов (в частности, белков, клеточных процессов и болезней), а также функциональные связи между ними, сформированные в результате обработки текстового массива полнотекстовых статей и абстрактов, индексированных в MEDLINE.

В качестве модели случайного пересечения множеств использовалось гипергеометрическое распределение. Распределение процессов по приоритетам проводилось программой. Чем меньше значение p, тем больше вероятность, что гены, попавшие в конкретный процесс, отнесены к нему не случайно. Результат считался значимым при p = 0,01. С увеличением генеральной совокупности значение p уменьшается, то есть вероятность того, что в произвольной выборке количество отмеченных объектов не случайно, возрастает.

Результаты и их обсуждение

Нами проанализирован список генов (база данных ResNet®), имеющих отношение к В1- и гамма-дельта-Т-клеткам, транскрипция которых достоверно регулируется внутриклеточными сигнальными каскадами, описанными в литературе.

Результаты проведенной работы подтвердили, что гамма-дельта-Т-клетки участвуют в функционировании В1-лимфоцитов. На рисунке 1 представлены возможные пути взаимодействия этих субпопуляций.

Один из таких сигнальных путей приводит к продукции IgM. Как было отмечено ранее, B1-клеткам для ответа на антиген и синтеза/секреции антител не требуется помощь классических Т-клеток. ТН-2-антиген альфа (1→3) декстран благодаря своей структуре с регулярно повторяющимися одинаковыми эпитопами вызывает перекрестное связывание (кластеризацию) нескольких комплексов BCR и таким образом обеспечивает сигнал, достаточный для активации В1-лимфоцитов. Первыми образуются IgM-антитела.

Важную функцию в переключении изотипов иммуноглобулинов В-клетками с IgM на другие классы выполняет индуцированная активацией цитидин дезаминаза (AID). AID участвует в соматическом гипермутировании (SHM), конверсии генов и рекомбинации при переключении изотипов иммуноглобулинов в B-клетках иммунной системы. В настоящее время AID признана основным ферментом, обеспечивающим разнообразие изотипов иммуноглобулинов.

У мышей с врожденным дефицитом AID количество непатогенных анаэробных бактерий в тонкой кишке увеличено. Кроме того, у них образуется много лимфоидных фолликулярных структур, выстилающих тонкую кишку. У пациентов с иммунодефицитом изменена кишечная микрофлора. Дисбаланс микрофлоры кишечника и других слизистых оболочек связан с блокировкой AID-опосредованной рекомбинации при переключении изотипа (для получения IgA) в В-лимфоцитах [10].

Механизм действия AID заключается в замене цитидина на уридин в молекуле ДНК, что приводит к точечным мутациям и рекомбинации генов иммуноглобулинов.

Результаты проведенного биоинформационного анализа продемонстрировали, что AID играет большую роль в функционировании В1-клеток.

Нами установлено, что транскрипционный фактор каппа-би (NF-κB) способствует индукции AID в В1-клетках, а также интерлейкинов (IL) 2 и 4 Т-лимфоцитами. IL-2 влияет на дифференцировку и пролиферацию Т-лимфоцитов, вырабатывается Т-клетками в ответ на антигенную и митогенную стимуляцию. Для образования IL-2 гамма-дельта-Т-клетками требуется стимуляция через CD28 [11]. Другой цитокин, вырабатываемый Т-клетками, – IL-4. Он регулирует рост и дифференцировку В-лимфоцитов, а также процессы биосинтеза и секреции антител. Установлено, что его могут вырабатывать гамма-дельта-Т-лимфоциты, в частности, при контактных дерматитах, вызванных стероидами [12].

Таким образом, данные, полученные с помощью биоинформационного анализа, позволяют спрогнозировать влияние гамма-дельта-Т-клеток на B1-лимфоциты посредством выработки IL-2 и -4.

Был выявлен также ряд маркеров, вовлеченных в функциональную активность В1-лимфоцитов. Распознавание IL-2 рецепторами (IL-2RG и IL-2RB) приводит к активации тирозинкиназ JAK1 и JAK3. Активация JAK1 происходит также при активации рецептора IL-4 (IL-4R). JAK1 и JAK3 обеспечивают фосфорилирование STAT6 и STAT5A, за счет чего происходит активация AID и RAG-полимеразы (RAG1 и RAG2) (RAG – ген, активирующий рекомбинацию).

Таким образом, воздействие IL-2 и -4 на B1-клетки должно вызывать рекомбинацию V-генов иммуноглобулинов. Ранее было показано, что STAT6 и NF-kB ассоциированы с индукцией ряда генов [13–15] и между этими факторами транскрипции существует взаимодействие [16]. Синергический эффект STAT6 и NF-kB, по-видимому, лежит в основе связи между распознаванием IL-4 и CD40 и индукцией экспрессии гена AID [17].

Еще один фактор, который был выявлен в результате биоинформационного анализа, – рецептор CD40. Последний при взаимодействии с CD40L (CD154) способен вызывать активацию и пролиферацию B-клеток. Следует отметить, что лиганд CD40 – CD40L является характерным маркером для CD4⁺-Т-клеток и нетипичным – для гамма-дельта-Т-клеток. Однако в литературе упоминается о CD4⁺-гамма-дельта-Т-лимфоцитах [18] и об экспрессии CD40L на активированных гамма-дельта-Т-лимфоцитах [19].

Гамма-дельта-Т-клетки могут выступать как АПК для CD4⁺-T-лимфоцитов [20], что позволяет предположить косвенное их влияние на иммунный ответ.

По мере старения B1-клетки мыши перестают экспрессировать в больших количествах костимулирующую молекулу CD86 и становятся мощными активаторами CD8⁺-T-клеток [21], а так как часть гамма-дельта-Т-лимфоцитов в кишечнике являются CD8⁺, нельзя исключать возможность прямого взаимодействия B1-клеток с гамма-дельта-Т-клетками (рис. 2).

В разных источниках встречаются данные о том, что В1-клетки могут быть и ТЗ. B B1-клетках отсутствуют существенные дефекты, которые не позволяли бы отвечать на Т-клеточные стимулы, включая CD40L, IL-4 и -5 [22]. IL-5 также способен стимулировать пролиферацию B1-клеток в отсутствие CD40 – CD40L взаимодействия [23].

Опираясь на анализ литературы и результаты, полученные с использованием биоинформационного анализа, можно предположить, что подобное взаимодействие между В1- и гамма-дельта-Т-клетками возможно.

Установлено, что регуляция на уровне miRNA и др. критична для развития и нормального функционирования иммунной системы. Позднее был выявлен ряд miRNA, которые могут участвовать на разных стадиях гемопоэза [24] и вносить вклад в окончательную дифференцировку взрослых лимфоцитов [25].

В большинстве случаев miRNA выступают в роли ингибиторов внутриклеточных процессов. Так, проведенный нами анализ позволил получить данные о влиянии miRNA155 и miRNA146a на AID, приводящем к ее угнетению как напрямую, так и опосредованно через подавление NF-kB [26]. Рецептор Notch, регулирующий клеточную дифференциацию, является типичной мишенью для miRNA326 [27]. В дифференциации B-клеток немаловажную роль играет miRNA181A [27].

Используемый нами метод позволил проанализировать несколько видов miRNA, а также установить возможные точки их воздействия на основные внутриклеточные процессы.

Оценка вклада некоторых miRNA в эти процессы может служить альтернативным подходом для анализа взаимодействия B1- и гамма-дельта-Т-лимфоцитов.

Данное научное направление представляет интерес не только в области фундаментальной иммунологии. Известно, что B1- и гамма-дельта-Т-клетки участвуют в развитии ряда заболеваний. Так, В1-лимфоциты задействованы в развитии Th2-опосредованного колита [28], а гамма-дельта-Т-клетки могут играть протективную роль для эпителиальных клеток и содействовать развитию воспалительных процессов [29]. Исследование механизмов активации или супрессии воспаления в кишечнике позволит в перспективе выявить мишени для терапевтического воздействия и реализовать персонализированный подход.

Полученные в исследовании данные свидетельствуют, что B1- и гамма-дельта-Т-клетки могут выступать в качестве новых терапевтических мишеней.

Терапия многих заболеваний (в частности, воспалительных и инфекционных) тесно связана с молекулярными технологиями. Подходы к miRNA-опосредованной регуляции активности клеток занимают в ней не последнее место. Они потенциально могут быть использованы для регуляции воспалительных процессов в кишечнике.

Однако остается ряд вопросов: создание комплексного препарата или монопрепаратов, которые будут менять ряд клеток или будут направлены только на определенный эффект, а также доставку нуклеиновых кислот (регуляторных РНК).

Заключение

Биоинформационный подход, используемый нами для прогнозирования путей взаимодействия B1- и гамма-дельта-Т-лимфоцитов, позволил определить наиболее вероятные из них и основные сигнальные каскады, участвующие в таком взаимодействии. Кроме того, метод дал возможность спрогнозировать участие некоторых видов miRNA в этих процессах.

Дальнейшее изучение связи между B1- и гамма-дельта-Т-лимфоцитами позволит по-новому взглянуть на патогенез ряда заболеваний, в которых участвуют субпопуляции этих клеток.