Опыт использования генетических исследований слюны для ранней диагностики рака молочной железы

Рак молочной железы (РМЖ) – самое распространенное злокачественное новообразование у женщин. Ежегодно в мире регистрируется более двух миллионов новых случаев РМЖ, и уровень заболеваемости постоянно увеличивается [1]. В России в 2023 г. зарегистрировано более 81 тысячи случаев [2]. В результате внедрения скрининговых мероприятий, современных методов диагностики и лечения РМЖ в последние годы уровень смертности от этой патологии снижается, особенно среди тех женщин, у которых рак был выявлен на ранних стадиях. В России показатель ранней диагностики РМЖ в 2023 г. составил 75,2% [2–4].

На протяжении многих лет существующие программы профилактики РМЖ включали традиционные методы, при которых женщины проходили стандартные мероприятия скрининга. Маммография включена в эти программы исследования как в развитых странах Европы, так и в нашей стране. Но традиционный подход в ряде случаев может оказаться небезвредным [5].

Национальные программы скрининга не принимают во внимание индивидуальные риски. Однако высокая маммографическая плотность и определенные структурные особенности молочной железы, отягощенный семейный анамнез и генетические варианты предрасположенности к РМЖ известны как одни из главных факторов риска. Поэтому в последнее время все больше внимания начинают уделять новым методам персонализированного скрининга РМЖ для каждого пациента в зависимости от уровня риска.

До четверти всех случаев РМЖ относятся к наследственным, при этом около 20% случаев связаны с высокопенетрантными мутациями в генах BRCA1/2 [6]. Потеря функции BRCA1 приводит к дефектам репарации ДНК и увеличению количества активных форм кислорода (АФК), что представляет угрозу стабильности генома. Белок BRCA1 участвует в поддержании целостности генома за счет процессов репарации ДНК, а также в ответе на окислительный стресс. Роль этого белка в защите клеток от оксидативного стресса обеспечивается посредством множественной активации экспрессии генов, ответственных за цитопротекторный антиоксидантный ответ. Имеющиеся данные говорят о том, что гиперэкспрессия гена/белка BRCA1 повышает устойчивость клеток к действию агентов-окислителей, а его дефицит, наоборот, усиливает чувствительность к воздействию оксидативных факторов.

Можно согласиться с мнением зарубежных авторов, что ген BRCA1 важен для поддержания адекватного для организма состояния оксидативного гомеостаза [7].
Любой дефект в гене BRCA1 может увеличивать продукцию АФК и нарушать клеточный окислительно-восстановительный статус. Потеря функции BRCA1 приводит к серьезным дефектам репарации двухцепочечных разрывов ДНК и увеличению количества АФК, которые представляют угрозу стабильности генома.

BRCA1 как сенсор и регулятор АФК потенциально важен для профилактики и/или лечения BRCA1-ассоциированных опухолей. BRCA1 контролирует АФК и выживаемость клеток молочной железы посредством антиоксидантной сигнализации, управляемой фактором транскрипции NRF2, который индуцирует экспрессию большого набора генов, модулирующих восстановление окислительно-восстановительного баланса и смягчающих повреждение от АФК. Этот сигнальный путь является центральным в поддержании оксидативного гомеостаза во многих типах клеток.

Приведенная в данном обзоре информация позволяет лучше понять роль гена BRCA1 и кодируемого им белка BRCA1 в реакции на окислительный стресс и в модуляции окислительно-восстановительного гомеостаза, а также уяснить существующие представления о биохимических и патофизиологических аспектах участия BRCA1 в этих процессах.

Открытие клинически значимых мутаций, способствующих развитию РМЖ, является важным шагом в развитии молекулярной онкологии, так как они приводят к возникновению гетерогенных опухолей, различающихся по своему происхождению. Эти мутации играют значительную роль в прогрессировании заболевания и в настоящее время подлежат генетическому тестированию и лечению препаратами группы PARP-ингибиторов. Обнаружение мутаций BRCA1/2 у больных РМЖ определяет необходимость обследования их родственников для выявления здоровых носителей мутаций BRCA1/2 и обеспечения диагностики злокачественных новообразований на ранних стадиях, когда лечение наиболее эффективно.

Актуальной проблемой клинической онкологии является разработка информативных, эффективных и неинвазивных методов диагностики опухолей. В этой связи любой новый диагностический подход, который потенциально может улучшить раннюю диагностику рака и мониторинг заболеваний, предполагает повышение общей выживаемости пациентов и заслуживает рассмотрения [8].

В последние годы в качестве надежной биожидкости для обнаружения системных патологических состояний, таких как злокачественные новообразования, стали рассматривать смешанную слюну (ротовую жидкость), молекулярные компоненты которой могут отражать системный статус организма [9]. Одна из современных тенденций в раннем выявлении РМЖ указывает на возможное решение – использование биомаркеров цельной слюны.

В настоящее время имеется ограниченное количество данных, подтверждающих использование биомаркеров слюны в качестве диагностического инструмента для выявления РМЖ. Наиболее исследованными био­маркерами в составе смешанной слюны при РМЖ являются эпидермальный фактор роста, раковый антиген 15-3 и рецептор эпидермального фактора роста HER2/neu. По данным литературы, целесо­образно использование слюны в качестве альтернативы крови для обнаружения мутаций в генах BRCA1/2 при выявлении наследственных форм РМЖ.

Показано, что определение слюнной пероксидазы, конечных продуктов позднего гликирования, общего антиоксидантного статуса и малонового диальдегида может иметь существенное значение в неинвазивной диагностике РМЖ. Также для ранней диагностики РМЖ рассматривается возможность использования исследования профиля свободных аминокислот в слюне, транскриптомных биомаркеров – мРНК CSTA, TPT1, IGF2BP1, GRM1, GRIK1, H6PD, MDM4 и S100A8 и протеомного биомаркера – карбоангидразы VI, полиаминов, а также ряда метаболических белков.

Исследования слюны могут оказаться такими же эффективными, как и исследования биомаркеров крови в лабораторной диагностике РМЖ. Кроме этого, изучение и описание связей биохимических и генетических показателей крови и слюны при РМЖ представляет не только научную, но и практическую ценность для совершенствования лабораторных методов диагностики этого заболевания. Взаимосвязь биохимических и генетических факторов слюны и крови, а также перспективы использования их наиболее информативных взаимосвязей для ранней диагностики РМЖ в настоящее время становятся предметом детальных научных исследований.

Первым исследованным биомаркером в составе смешанной слюны при РМЖ был эпидермальный фактор роста (EGF) [10]. В слюне у пациентов с РМЖ были обнаружены повышенные концентрации EGF в сравнении со слюной у здоровых женщин, тогда как исследование плазмы дало противоположные результаты и не было корреляции между значениями EGF в плазме и слюне. Самые высокие значения EGF в слюне обнаружены в подгруппе пациентов с местными рецидивами. В то же время к систематическому изучению возможностей саливадиагностики РМЖ приступили исследователи отдела диагностических и биомедицинских наук Научного центра здоровья Техасского университета в Хьюстоне (США) под руководством профессора Чарльза Ф. Стрекфуса
(C.F. Streckfus). Уже в 1999 г. исследователи обнаружили наличие ракового антигена 15-3 (CA 15-3) и рецепторов эпидермального фактора роста (c-erbB-2) в слюне, взятой у 135 здоровых женщин [11].

Раковый антиген CA 15-3 сверхэкспрессируется при различных эпителиальных раках и играет главную роль в прогрессировании заболевания. CA 15-3 и CA 27-29 являются антигенами гликопротеина MUC-1.
Это биомаркеры, одобренные в США Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов (FDA) для мониторинга и оценки эффективности лечения запущенного или рецидивирующего РМЖ [12]. Сывороточный CA 15-3 в основном используется для определения прогноза РМЖ и эффективности терапии, поскольку сывороточный уровень СА 15-3 пропорционален стадии и размеру опухоли. CA 27-29 обладает более высокой чувствительностью и меньшей специфичностью, чем CA 15-3 [13]. HER2/neu (c-erbB-2) является важным биомаркером для диагностики разных типов РМЖ, предиктором прогрессирования HER2-положительных клеточных линий РМЖ, прогностическим индикатором снижения выживаемости пациенток с метастатическим РМЖ [14].

Кроме вышеперечисленных факторов, в 2000 г. были опубликованы первые результаты исследований содержания в слюне у пациенток с РМЖ рецептора эпидермального фактора роста (EGFR), p53, катепсина D, c-erbB-2 (HER2/neu) и ракового антигена CA 15-3 [15]. В ходе исследований впервые обнаружены в слюне у женщин с РМЖ довольно значимые в диагностическом плане уровни опухолевых маркеров: CA 15-3, c-erbB-2 и белка-супрессора онкогена 53 (p53). Уровни erb и CA 15-3 в слюне у исследуемых пациенток были значительно выше (на 50%), чем в слюне у здоровых контрольных субъектов и пациентов с доброкачественными опухолями. Результаты этого исследования предполагают, что эти маркеры потенциально могут использоваться при первоначальном выявлении РМЖ и/или последующем скрининге. Анализ экспрессии белка c-erbB-2 в слюне может быть очень полезным диагностическим инструментом для измерения реакции больной на химиотерапию и/или хирургическое лечение РМЖ. Было предложено определение HER2 в слюне для обнаружения HER2-типов РМЖ [16].

В этот же период другие исследователи проанализировали коррелятивную взаимосвязь между уровнем СА 15-3 в сыворотке и слюне. В группе пациенток с ранними стадиями РМЖ измерялись концентрации CA 15-3 в слюне и сыворотке по сравнению с конт­рольной группой [17]. Показатели концентрации CA 15-3 в слюне и сыворотке были выше на стадии II по сравнению со стадией I РМЖ. Несмотря на более низкую скорость слюноотделения у онкологических больных, наблюдалась значительная положительная корреляция между концентрациями CA 15-3 в сыворотке и слюне, а также между концентрациями CA 15-3 в сыворотке и дебитом CA 15-3 в слюне. Результаты этого исследования позволили предположить, что CA 15-3 слюны может потенциально использоваться для раннего выявлении РМЖ у женщин. Было проанализировано содержание CA 15-3 в слюне и сыворотке у пациенток с РМЖ и в контрольной группе здоровых добровольцев [18]. Результат сравнения концентраций CA 15-3 в слюне и в сыворотке ни в группе пациенток с РМЖ, ни в контрольной группе не был статистически значимым, однако корреляция между концентрациями СА 15-3 в слюне и сыворотке в каждой группе была положительной и статистически значимой. Это позволило авторам работы предположить, что слюна может быть альтернативой крови для лабораторного мониторинга РМЖ.

Одно из преимуществ слюны как источника геномной ДНК – ее стабильность при хранении и транспортировке. Сравнительные исследования, проведенные на образцах слюны и крови от доноров, констатировали более чем 97% совпадений в результатах генотипирования [19, 20].

Слюна больных РМЖ с мутацией BRCA1 характеризуется повышенной антиоксидантной способностью и более высокой степенью окислительного повреждения белков и липидов. Такие изменения не наблюдались у больных без мутации BRCA1. Авторы показали, что слюнная пероксидаза, конечные продукты позднего гликирования, общий антиоксидантный статус и малоновый диальдегид могут иметь особое клиническое значение в неинвазивной диагностике РМЖ [21].

Значимая проблема саливадиагностики состоит в том, что аналиты в слюне находятся в значительно более низких концентрациях, чем в крови. Из-за этого для поиска биомаркеров РМЖ целесообразно тестирование в слюне РНК, поскольку системы обнаружения РНК, такие как ПЦР, могут амплифицировать очень небольшие количества РНК [22].

Наиболее перспективным направлением поиска эффективных возможностей ранней диагностики РМЖ является использование панели биомаркеров. В исследовании, объединяющем транскриптомный и протеомный подходы, ученые определили профили транскриптома и протеома слюны у больных РМЖ. Показано, что комбинация восьми транскриптомных биомаркеров – мРНК (CSTA, TPT1, IGF2BP1, GRM1, GRIK1, H6PD, MDM4 и S100A8) и одного протеомного CA6 может быть использована для обнаружения и идентификации РМЖ с точностью 92%, чувствительностью 83% и специфичностью 97% [23].

Цель исследования: изучить возможности генетического тестирования слюны (ротовой жидкости) для скрининга РМЖ.

Материал и методы

Исследование проведено на базе ГБУЗ «Клинический онкологический диспансер № 1» Министерства здравоохранения Краснодарского края и ФГБОУ ВО «Кубанский государственный медицинский университет» Минздрава России. В исследовании участвовали
30 человек. Средний возраст составил 51,9±10,2 года. У 15 разных женщин с известными мутациями в локусах BRCA1 было проведено сравнение ДНК, выделенной из образцов крови, и ДНК из слюны с точки зрения обнаружения мутаций зародышевой линии. Еще у 15 обследованных с семейным анамнезом РМЖ проведено скрининговое исследование слюны для выявления ассоциированных с опухолью мутаций в гене BRCA1. Близкие родственники без клинических признаков РМЖ были из семей, в которых одна женщина имела в анамнезе РМЖ.

Последующее исследование венозной крови осуществлялось у лиц, у которых по данным генетического тестирования слюны были обнаружены мутации в гене BRCA1. Образцы цельной венозной периферической крови, полученные путем венепункции, собирали в пластиковые пробирки объемом 10 мл (Becton Dickinson), содержащие в качестве антикоагулянта К2ЭДТА. Сбор, предобработку и хранение ротовой жидкости и венозной крови для исследований генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития РМЖ, проводили в соответствии с инструкцией к комплекту для выделения ДНК из биологического материала.

Образец слюны помещали в стерильный пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой. За два часа до сбора слюны исследуемые женщины не принимали никакой пищи или напитков (за исключением чистой воды). За пять минут до сбора ротовой жидкости обследуемые женщины прополаскивали рот водой. Затем нестимулированную слюну собирали пассивным слюноотделением в отсутствие жевательных движений в стерильные пластиковые контейнеры емкостью 10 мл.

От каждого участника получено от 4 до 6 мл ротовой жидкости. Для соответствия критериям исследования образец не должен был иметь признаков присутствия крови. Сразу после сбора образцы слюны центрифугировали (скорость – 8000 оборотов в минуту, время – 15 минут) для удаления нежелательных частиц, затем супернатант собирали и разделяли на аликвоты. Часть аликвот каждого образца хранили при температуре 2–8 ºC в течение двух – четырех часов для последующего выполнения биохимических и генетических исследований ex tempore.

Для генетического тестирования образцов биоматериала применяли набор реагентов «ОнкоГенетика» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) для выделения ДНК из периферической крови и выявления наследственных мутаций 185delAG, 2080delA, 4153delA, 5382insC, c.3700 _ 3704delGTAAA,
c.3756 _ 3759delGTCT, 300T > G (Cys61Gly) в гене человека BRCA1 и 6174delT в гене человека BRCA2 методом ПЦР в режиме реального времени.

Подготовку к ПЦР проводили с использованием ПЦР-боксов. Применяли амплификатор детектирующий «ДТ лайт» производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия), совмещающий функции прецизионного программируемого термоциклера и оптической системы, которая позволяет регистрировать флуоресценцию реакционной смеси непосредственно в ходе ПЦР и осуществлять ее автоматически с помощью программного обеспечения Real Time PCR v.7.3, поставляемого с детектирующим амплификатором.

Результаты исследования и их обсуждение

Действующие программы скрининга РМЖ недостаточны для женщин с высоким генетическим риском, поэтому одним из современных методов обследования при подозрении на РМЖ является генетическое исследование на наличие мутаций, увеличивающих риски развития заболевания. Генетическое тестирование значительно улучшает качество программ профилактики РМЖ, помогает выявить лиц из группы высокого риска, которым требуется частое наблюдение, и женщин из группы низкого риска, которым следует избегать частых скрининговых исследований до последующего контроля [24]. По имеющимся данным, мутации в генах BRCA1 или BRCA2 повышают риски развития РМЖ до 60–70% [25].

С помощью специального генетического тестирования можно обнаружить мутирующие гены. Генетическое тестирование позволяет минимизировать вред, сопряженный со скринингом РМЖ, и индивидуализировать процесс раннего выявления и скрининга. Оценка генетических рисков также требуется здоровым пациенткам, имеющим близких родственниц с диагнозом «РМЖ» или «рак яичников», родственников любого пола с обнаруженными изменениями в генах BRCA1/2 либо с диагнозом «доброкачественная опухоль молочной железы» при признаках усиленного роста. 

Важным элементом любой программы генетических исследований является сбор биологических образцов для получения ДНК. На сегодняшний день при генетическом тестировании предпочтение отдается исследованию крови, которая наиболее часто используется как биоматериал для получения ДНК высокого качества, необходимого для анализа генов, ассоци­ированных с предрасположенностью к РМЖ. Для забора образцов крови требуется квалифицированный специалист. Процедура может вызывать боль, стресс и беспокойство у обследуемого, даже если человек совершенно здоров и тестирование BRCA проводится для прогнозирования риска. Необходимость сдачи крови в таких случаях может демотивировать некоторых потенциальных пациентов относительно тестирования. Непросто произвести сбор крови на анализ у новорожденных или людей с отклонениями в развитии или поведении. Поэтому неинвазивные методы получения биоматериала для генетического тестирования на предрасположенность к РМЖ представляют особый интерес [26].

В отличие от сбора крови, для сбора слюны не требуется обученный флеботомист. Слюну считают надежным источником ДНК для самых разных генетических исследований [5, 27]. Установлено, что по качеству геномной ДНК образцы слюны сопоставимы с образцами крови – по показателям чистоты, генотипирования и ПЦР-амплификации [28]. Простой, дешевый и неинвазивный онкологический скрининг РМЖ является ключом к реальному повышению эффективности ранней диагностики онкопатологии [29].

Ряд исследователей показали пригодность ДНК, выделенной из слюны, для высокопроизводительного молекулярного генотипирования путем сравнения ее эффективности с ДНК, выделенной из крови [30]. Слюну можно считать материалом, эквивалентным крови для генетического анализа как для полногеномного секвенирования, так и для секвенирования всего человеческого экзома [31]. Сообщается, что точность генотипирования ДНК, полученной из слюны, сравнима с точностью генотипирования ДНК, полученной из крови. Таким образом, ДНК слюны становится все более важным инструментом для обнаружения геномных вариаций.

Исходя из вышеизложенного, можно заключить, что слюна и биомаркеры имеют большой потенциал для клинического применения [32]. ДНК из крови и слюны показала частоту генотипирования и частоту воспроизводимости > 99%, это послужило основанием для вывода, что слюна является источником ДНК достаточного количества и качества для целей генетических исследований.

Сравнение ДНК, выделенной из образцов крови и слюны для обнаружения мутаций зародышевой линии у десяти разных людей с известными мутациями в локусах BRCA1, продемонстрировало наличие идентичных мутаций в 100% наблюдений. По результатам проведенного скринингового исследования слюны у 30% обследованных лиц с семейным анамнезом заболевания, но без клинических признаков РМЖ, выявлены ассоциированные с опухолью мутации в гене BRCA1. Последующее исследование венозной крови лиц, у которых по данным генетического тестирования слюны были обнаружены мутации в гене BRCA1, подтвердило их наличие. 

Заключение

Использование единственного биомаркера для диагностики, прогноза или лечения РМЖ, несомненно, упрощает процедуру, однако часто бывает недостаточно информативным. Одно из возможных решений – одновременное использование пула биомаркеров для достижения желаемой цели. По нашему мнению, перспективным и актуальным направлением в клинической онкологии представляется поиск новых взаимосвязей биомаркеров РМЖ путем параллельного анализа крови, слюны и разработки на этой основе эффективных тактик скрининговых и диагностических исследований. Следовательно, изучение и описание особенностей взаимосвязи исследуемых биохимических и генетических показателей крови и слюны при РМЖ представляет не только научную, но и практическую ценность для совершенствования лабораторных методов диагностики заболевания. Полагают, что исследование слюны с целью определения опухолевых маркеров не заменит стандартный скрининговый физикальный осмотр и маммографию. Тем не менее новый подход с использованием саливадиагностики может улучшить выявляемость РМЖ на ранних стадиях, когда он еще излечим, что согласуется с рядом зарубежных исследований [33].

Итоги проведенного нами исследования позволяют заключить, что зафиксированные результаты генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов слюны и крови могут рассматриваться как аргументы, свидетельствующие о целесообразности генетических тестирований для раннего выявления и скрининга РМЖ. Результаты исследования свидетельствуют, что скрининг слюны может предоставить информацию о наличии мутаций в генах, ассоциированных с предрасположенностью к РМЖ, у близких родственников пациентов с диагностированным РМЖ. Это особенно важно для раннего выявления и оценки молекулярной гетерогенности заболевания. Возможно, сочетание генетического тестирования слюны и крови станет основой разработки эффективной тактики скрининга и диагностики.

Необходимы дополнительные, расширенные исследования возможностей тестирования слюны для выявления мутаций в гене BRCA1 и использования этой методики наряду с другими общепринятыми методами выявления диагностических биомаркеров РМЖ.