количество статей
5391
Загрузка...
Исследования

Особенности клеточного звена иммунитета и цитокинового профиля у больных хроническим лимфолейкозом на фоне терапии Ферровиром

А.В. Йовдий
В.И. Шардаков
Т.П. Загоскина
Е.Л. Назарова
Фан Тронг Лан
Кировский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи,
Министерство здравоохранения Вьетнама
"ЭФФЕКТИВНАЯ ФАРМАКОТЕРАПИЯ. Онкология, Гематология и Радиология" №3
  • Аннотация
  • Статья
  • Ссылки
  • Комментарии
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является опухолью кроветворной системы, которая характеризуется пролиферацией и аккумуляцией морфологически зрелых лимфоцитов, в большинстве случаев имеющих фенотип В-клеток. ХЛЛ – наиболее распространенный вид хронического лейкоза в странах Европы и Северной Америки, где на долю этого заболевания приходится до 30% от всех лейкозов (1). Достоверной информации о заболеваемости и распространенности ХЛЛ в России нет. Экстраполяция европейских данных позволяет считать, что ежегодно в России заболевают 3600 человек (18).
  • КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммунитет, лимфолейкоз, лимфоциты, цитокины, интерлейкин, Ферровир
Хронический лимфолейкоз (ХЛЛ) является опухолью кроветворной системы, которая характеризуется пролиферацией и аккумуляцией морфологически зрелых лимфоцитов, в большинстве случаев имеющих фенотип В-клеток. ХЛЛ – наиболее распространенный вид хронического лейкоза в странах Европы и Северной Америки, где на долю этого заболевания приходится до 30% от всех лейкозов (1). Достоверной информации о заболеваемости и распространенности ХЛЛ в России нет. Экстраполяция европейских данных позволяет считать, что ежегодно в России заболевают 3600 человек (18).
Таблица 1. Уровень спонтанной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ и здоровых лиц
Таблица 1. Уровень спонтанной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ и здоровых лиц
Таблица 2. Уровень стимулированной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ и доноров крови
Таблица 2. Уровень стимулированной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ и доноров крови
Таблица 3. Характеристика субпопуляционного состава лимфоидных клеток больных ХЛЛ и доноров крови
Таблица 3. Характеристика субпопуляционного состава лимфоидных клеток больных ХЛЛ и доноров крови
Таблица 4. Содержание цитокинов в супернатанте культуральной взвеси лимфоидных клеток больных ХЛЛ
Таблица 4. Содержание цитокинов в супернатанте культуральной взвеси лимфоидных клеток больных ХЛЛ
Таблица 5. Уровень стимулированной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ
Таблица 5. Уровень стимулированной продукции цитокинов лимфоидными клетками больных ХЛЛ
Таблица 6. Динамика субпопуляционного состава лимфоидных клеток больных ХЛЛ
Таблица 6. Динамика субпопуляционного состава лимфоидных клеток больных ХЛЛ

Течению ХЛЛ сопутствует угнетение иммунной системы, что приводит к повышенному риску развития инфекционных осложнений у этой категории больных. В структуре их смертности бактериальные, грибковые и вирусные инфекции составляют около 60%. Нередко инфекционные осложнения бывают первыми проявлениями болезни (2, 3). Причины иммунных нарушений у больных ХЛЛ многообразны. Во-первых, наблюдается вытеснение опухолевыми клетками нормальной лимфоидной популяции (4). Во-вторых, опухолевый клон представлен морфологически зрелыми, но функционально малоактивными лимфоидными клетками, неспособными в большинстве случаев к дифференцировке в плазматические клетки и, следовательно, к реализации полноценного иммунного ответа (5, 6). В-третьих, опухолевые клетки, наряду с другими мононуклеарами, способны вырабатывать ряд иммуносупрессивных факторов, подавляющих нормальную функцию иммунной системы и способствующих прогрессированию опухолевого роста (7, 8, 9).

У больных ХЛЛ большинство авторов выявили понижение величины иммунорегуляторного индекса за счет увеличения числа CD8+-лимфоцитов (6, 10, 12). Ряд исследователей отмечают также снижение показателей CD3+, CD4+, CD8+-лимфоцитов (13). Кроме того, в ряде научных работ показана функциональная неполноценность Т-лимфоцитов (11).

Приводятся данные, что проведение химиотерапии у больных ХЛЛ усугубляет иммунные нарушения (6, 14, 15, 16, 17). Подтверждением служит тот факт, что наиболее часто вирусные и грибковые инфекции наблюдаются по окончании курсов полихимиотерапии и сочетаются с наличием дефекта Т-клеточного иммунитета. Так, в ряде исследований, посвященных влиянию химиотерапии на иммунные показатели, обнаружено достоверное снижение числа CD 4+- и CD 8+-лимфоцитов (15, 17).

Учитывая высокую частоту инфекционных осложнений у больных ХЛЛ, актуальной является проблема проведения профилактических мероприятий, включающих применение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов. Одной из последних разработок российской фармакологической отрасли стал противовирусный препарат Ферровир®. Доказано, что данный препарат у людей, страдающих вирусной инфекцией, способен влиять на фагоцитарную активность макрофагов и Т-клеточное звено иммунитета. К сожалению, исследований, отражающих влияние Ферровира на противовирусный иммунитет у больных опухолями лимфатической системы (ОЛС), в литературе не представлено. Целью настоящей работы явилась оценка влияния препарата Ферровир® на состояние иммунитета у больных ХЛЛ, получающих базисную химиотерапию.

Материалы и методы

В исследование были включены 13 человек больных ХЛЛ в возрасте от 43 до 72 лет (медиана – 57 лет). Диагноз подтвержден на основании морфологических и иммуногистохимических исследований. Стадию заболевания определяли согласно классификации K. Rai (1975 г.), при этом у 8 больных была выявлена ІІ стадия заболевания, у 3 – ІІІ стадия, у 2 – ІV стадия. Все больные получали современные программы химиотерапии. Четверо из них проходили лечение по программе RFC, а девять человек – Campath–1H.

Препарат Ферровир® назначали по 5 мл (1 флакон) с 1 мл 0,25% новокаина внутримышечно 1 раз в сутки ежедневно на протяжении 10 дней. Курсовая доза составила 750 мг. Исследования иммунного статуса проводили до начала терапии, а также сразу после окончания курса лечения, через 1, 3, 6 месяцев. Анализировали показатели Т-звена иммунитета, уровень ряда цитокинов (интерлейкина (ИЛ) – 1β, -2, -4, -6, -8, -10, фактора некроза опухолей-α (ФНО-α), интерферона-α и интерферона-γ (ИФН-α и -γ) в супернатанте культуральной взвеси лимфоидных клеток. В группы сравнения вошли 54 больных ХЛЛ, не получавших иммуномодулирующую терапию, и 31 здоровый житель региона.

Лимфоидные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/л). Лимфоциты для исследований использовали в рабочей концентрации 2х106 в 1 мл. Культивирование клеток проводили в 96 луночных планшетах для иммунологических исследований при 37°C в СО2-инкубаторе в среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина. Для стимуляции клеток использовали фитогемагглютинин в концентрации 100мкг/мл культуральной взвеси. Продолжительность инкубации составляла 72 часа для ИФН-α и ИФН-g, а для остальных цитокинов – 24 часа.

Концентрацию цитокинов в супернатанте культуральной взвеси определяли в иммуноферментном анализе с использованием коммерческих наборов реагентов ООО «Вектор–Бест» (п. Кольцово Новосибирской области, Россия).

Определение поверхностных антигенных детерминант лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+) проводили в лимфоцитотоксическом тесте (P.I. Tarasaki et al., 1970 г.) с использованием специфических моноклональных антител (OOO «Сорбент» г. Москва).

Для статистической обработки полученных данных использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2007. Достоверность различий полученных показателей подтверждали с помощью расчета непараметрического критерия U (Вилкоксона–Манна–Уитни).

Результаты и обсуждение

Проведена оценка иммунокорригирующего влияния Ферровира у 13 больных ХЛЛ: изучена динамика уровней ряда цитокинов, а также показателей Т-клеточного иммунитета. В ходе исследований нами получены следующие результаты (таблица 1).

Из представленных в таблице данных видно, что спонтанная продукция большинства цитокинов у больных ХЛЛ лимфоцитами крови снижена. Так, оказались низкими концентрации ФНО-α, ИЛ-1β, -4, -8, -10, ИФН-α, ИФН-g. При этом уровни ИЛ-2 и -6 имели тенденцию к повышению.

Для анализа способности лимфоцитов к синтезу цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию было проведено их культивирование с фитогемагглютинином. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Из полученных результатов следует, что сохранность цитокинсекретирующей функции лимфоидных клеток больных ХЛЛ наблюдалась только в отношении ИЛ-4 и -6. Остальные показатели в группе обследуемых больных имели достоверно более низкое значение по сравнению с данными здоровых лиц. Такие изменения в цитокиновом профиле больных ХЛЛ, вероятнее всего, связаны со снижением функциональной активности опухолевых клеток, составляющих основной пул мононуклеаров периферической крови.

Анализируя полученные данные, можно отметить, что при опухолях лимфатической системы, в частности, при ХЛЛ, имеется дисбаланс в синтезе цитокинов вследствие вовлечения в патологический процесс значительной часть цитокинпродуцирующих лимфоидных клеток.

Изменения в цитокиновом каскаде, наблюдаемые у больных ОЛС, оказывают влияние на все основные функции лимфоцитов, включая реализацию противовирусного иммунного ответа. Из данных таблицы 1 видно, что в культуре лимфоцитов содержание ИЛ-4, -6, -10 у больных ХЛЛ значительно превышало уровень ИЛ-2 и ИФН-g, в отличие от показателей группы здоровых лиц, что в основном связано с угнетением синтеза ИФН-g. При этом показатели, отраженные в таблице 2, свидетельствуют о сохранности цитокинсекретирующей функции лимфоидных клеток больных ХЛЛ, по сравнению с данными группы доноров крови, только в отношении ИЛ-4 и -6.

Происходящие в системе иммунорегуляторных пептидов изменения коррелировали с субпопуляционным составом лимфоидных клеток (таблица 3).

Из представленных в таблице 3 данных видно, что относительное содержание СD3+-, СD4+-, СD8+- и СD16+-лимфоцитов у больных ХЛЛ достоверно ниже аналогичных показателей группы сравнения.

Исходя из вышесказанного, особое значение приобретает состояние противовирусного иммунитета у больных ОЛС на фоне проведения полихимиотерапии (ПХТ). Для этих целей нами была отобрана группа больных ХЛЛ, получавшая в качестве сопроводительной терапии препарат Ферровир® (Р №000630/01 от 08.12.06, ЗАО ФП «Техномедсервис», Москва). Данный препарат относится к группе противовирусных средств с иммуномодулирующим эффектом. Ферровир® применялся внутримышечно 1 раз в сутки в курсовой дозе 750 мг. Для оценки иммуномодулирующего действия препарата проведен анализ динамики некоторых показателей цитокинового и иммунного статуса. В супернатанте культуры мононуклеаров крови после терапии Ферровиром определяли содержание исследуемых цитокинов (таблица 4).

Полученные результаты свидетельствовали об изменении синтеза цитокинов мононуклеарами крови больных ХЛЛ на фоне применения Ферровира, в частности, наблюдалось повышение секреции ФНО-α и снижение уровней ИЛ-1β и -6.

Некоторые авторы в своих исследованиях указывают на способность ФНО-α индуцировать синтез ИЛ-1β и -6 моноцитами крови. В нашем случае данная тенденция не прослеживается. Снижение уровня ИЛ-6 у больных ХЛЛ могло свидетельствовать об уменьшении активности Т-хелперов 2 типа, что явилось, скорее всего, позитивным фактором реализации противовирусного иммунитета и динамики опухолевого процесса.

Для изучения ответа мононуклеарных клеток крови на антигенную стимуляцию по окончании курса терапии Ферровиром была проведена оценка синтеза цитокинов после культивирования лимфоидных элементов с фитогемагглютинином (таблица 5).

В отличие от спонтанной продукции цитокинов, наблюдалось снижение уровня ИЛ-2.

Следовательно, полученные в ходе исследования данные позволили предположить наличие у Ферровира цитокинмодулирующей активности, направленной на активацию противовирусного звена иммунитета даже в случаях лимфоидных опухолей.

Для выявления возможной взаимосвязи между изменениями показателей цитокинового профиля и количеством иммунокомпетентных клеток проведен анализ субпопуляционного состава лимфоцитов после курса терапии Ферровиром (таблица 6).

Из представленных в таблице 6 данных видно, что количество лимфоцитов, несущих определенный маркер у пациентов до лечения и после окончания терапии не имели значимых отличий. При этом наблюдалась тенденция к росту числа СD3+-лимфоцитов и естественных киллерных клеток. При обследовании пациентов через месяц отмечено достоверное увеличение относительного числа СD3+-и СD4+-лимфоцитов. К третьему месяцу содержание данных клеток снижалось и приближалось к значениям, выявленным сразу после окончания терапии. Следующий пик роста количества СD3+- и СD4+-лимфоцитов наблюдался через 6 месяцев и, возможно, был связан с тропностью Ферровира к лимфоидной ткани и последующей элиминацией эндолимфатическим путем к органам-мишеням.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХЛЛ имеются изменения цитокинового профиля со смещением баланса иммунорегуляторных пептидов, соответствующих активности Т-хелперов 2 типа. У пациентов отмечено уменьшение относительного содержания СD3+-, СD4+-, СD8+- и СD16+-лимфоцитов. В комплексе подобные изменения свидетельствовали о снижении противовирусной защитной реакции организма. Результаты, полученные при применении препарата Ферровир у иммунокомпрометированных лиц, подтвердили приведенные в литературе данные о том, что препарат оказывает влияние на реализацию противовирусного ответа. У больных ХЛЛ данный противовирусный эффект заключался в виде модуляции цитокинового профиля и Т-звена иммунитета.

  • КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: иммунитет, лимфолейкоз, лимфоциты, цитокины, интерлейкин, Ферровир

1. Гематология: руководство для врачей; под ред. Н.Н. Мамаева, С.И. Рябова. – СПб.: СпецЛит. 2008; с. 313-324.
2. Molica S. Infections in chronic lymphocytic leukemia: Risk factors and impact on survival, and treatment Molica S. // Leuk. Lymphoma. 1994; Vol. 13: 203-214.
3. Elias J. Anaissie., Dimitrios P. Kontoyiannis, Susan O’Brien. et. al. Infections in Patients with Chronic Lymphocytic Leukemia Treated with Fludarabine // Annals of Internal Medicine. 1998; Vol: 129; 559-566.
4. Клиническая онкогематология: руководство для врачей; под ред. М. А. Волковой // М.: Медицина. 2001; с. 376-394.
5. Виноградова Е.Ю., Варламова Е.Ю., Леках И.В. и др. Свободно циркулирующие и скрытые аутоантитела в сыворотке больных В-клеточными лимфатическими опухолями // Иммунология. 2008; №6, с. 370-372.
6. Короткова О.В., Ларионова В.Б., Заботина Т.Н. и др. Особенности нарушения иммунного статуса у больных лимфопролиферативными заболеваниями после высокодозной полихимиотерапии с последующей трансплантацией клеток предшественников // Аллергология и иммунология. 2002. Т 3; № 1, с. 105-110.
7. Антонов В.Г., Антонов В.Г., Козлов В.К. Патогенез онкологических заболеваний: иммунные и биохимические феномены и механизмы. Внеклеточные и клеточные механизмы общей иммунодепрессии и иммунной резистентности // Цитокины и воспаление. 2004. Т. 3, № 1, с. 8-19.
8. Schindler R., Mancilla J.,Endres S. et al. Correlations and interactions of interleukin -6 (IL-6), IL-1, and tumor necrosis factor (TNF) in human blood mononuclear cells: IL-6 suppress IL-1 and TNF // Blood. 2006. Vol. 75: 40-47.
9. Mielcarek M., Graf L., Johnson G. et al. Production of interleukin – 10 by granulocyte colony – stimulating factor – mobilized blood products: a mechanism for monocyte – mediated suppression of T – cell proliferation // Blood. 1998. Vol. 2, № 1: 215-222.
10. Долгополова Е.В., Никитин И.Ю., Цыган И.Н. и др. Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса больных неходжкинскими лимфомами // Медицинская иммунология. 2003. Т.3, № 2, 3, с. 197-198.
11. Görgün Güllü, Holderried Tobias A.W., Zahrieh David, Neuberg Donna, Gribben John G. Chronic lymphocytic leukemia cells induce changes in gene expression of CD4 and CD8 T cells // The Journal of clinical investigation. 2005. Vol. 115, № 7: 1797-1805.
12. Platsoucas C.D. et al. Abnormal T lymphocyte subpopulation in patients with B cell CLL // J. Immunol. 1982. Vol. 129: 2305-2312.
13. Dianzani U., Omede P., Marmont F. et al. Expansion of T cell expressing low CD4 or CD8 levels in B – cell chronic lymphocytic leukemia: Correlation with disease status and neoplastic phenotype // Blood. 1994. Vol. 83: 2198-2205.
14. Mackall C.M., Fleischer T., Brown M. et al. Lymphocyte depletion during treatment with intensive chemotherapy for cancer // Blood. 1994. Vol. 84: 2221-2228.
15. Шевела Е.А., Сизикова С.А., Тихонова М.А. и др. Характеристика нарушений функциональной активности Т-клеток у больных лимфомами при проведении программной полихимиотерапии // Гематол. и трансфузиол. 2004. Т. 49, № 1, с. 15-19.
16. Бялик Т.Е., Волкова М.А., Андреева Л.Ю. и др. Флударабин в лечении хронического лимфолейкоза // Гематол. и трансфузиол. 2004. Т. 49, № 3, с. 6-11.
17. Волкова М.А. Моноклональные антитела к антигену СD53: оптимизация терапии хронического лимфолейкоза // Гематол. и трансфузиол. 2006. Т. 51, № 2, с. 27-32.
18. www.rg.ru/2007/08/14/onkologiya.html.