Особенности клеточного звена иммунитета и цитокинового профиля у больных хроническим лимфолейкозом на фоне терапии Ферровиром
- Аннотация
- Статья
- Ссылки
Течению ХЛЛ сопутствует угнетение иммунной системы, что приводит к повышенному риску развития инфекционных осложнений у этой категории больных. В структуре их смертности бактериальные, грибковые и вирусные инфекции составляют около 60%. Нередко инфекционные осложнения бывают первыми проявлениями болезни (2, 3). Причины иммунных нарушений у больных ХЛЛ многообразны. Во-первых, наблюдается вытеснение опухолевыми клетками нормальной лимфоидной популяции (4). Во-вторых, опухолевый клон представлен морфологически зрелыми, но функционально малоактивными лимфоидными клетками, неспособными в большинстве случаев к дифференцировке в плазматические клетки и, следовательно, к реализации полноценного иммунного ответа (5, 6). В-третьих, опухолевые клетки, наряду с другими мононуклеарами, способны вырабатывать ряд иммуносупрессивных факторов, подавляющих нормальную функцию иммунной системы и способствующих прогрессированию опухолевого роста (7, 8, 9).
У больных ХЛЛ большинство авторов выявили понижение величины иммунорегуляторного индекса за счет увеличения числа CD8+-лимфоцитов (6, 10, 12). Ряд исследователей отмечают также снижение показателей CD3+, CD4+, CD8+-лимфоцитов (13). Кроме того, в ряде научных работ показана функциональная неполноценность Т-лимфоцитов (11).
Приводятся данные, что проведение химиотерапии у больных ХЛЛ усугубляет иммунные нарушения (6, 14, 15, 16, 17). Подтверждением служит тот факт, что наиболее часто вирусные и грибковые инфекции наблюдаются по окончании курсов полихимиотерапии и сочетаются с наличием дефекта Т-клеточного иммунитета. Так, в ряде исследований, посвященных влиянию химиотерапии на иммунные показатели, обнаружено достоверное снижение числа CD 4+- и CD 8+-лимфоцитов (15, 17).
Учитывая высокую частоту инфекционных осложнений у больных ХЛЛ, актуальной является проблема проведения профилактических мероприятий, включающих применение противовирусных и иммуномодулирующих препаратов. Одной из последних разработок российской фармакологической отрасли стал противовирусный препарат Ферровир®. Доказано, что данный препарат у людей, страдающих вирусной инфекцией, способен влиять на фагоцитарную активность макрофагов и Т-клеточное звено иммунитета. К сожалению, исследований, отражающих влияние Ферровира на противовирусный иммунитет у больных опухолями лимфатической системы (ОЛС), в литературе не представлено. Целью настоящей работы явилась оценка влияния препарата Ферровир® на состояние иммунитета у больных ХЛЛ, получающих базисную химиотерапию.
Материалы и методы
В исследование были включены 13 человек больных ХЛЛ в возрасте от 43 до 72 лет (медиана – 57 лет). Диагноз подтвержден на основании морфологических и иммуногистохимических исследований. Стадию заболевания определяли согласно классификации K. Rai (1975 г.), при этом у 8 больных была выявлена ІІ стадия заболевания, у 3 – ІІІ стадия, у 2 – ІV стадия. Все больные получали современные программы химиотерапии. Четверо из них проходили лечение по программе RFC, а девять человек – Campath–1H.
Препарат Ферровир® назначали по 5 мл (1 флакон) с 1 мл 0,25% новокаина внутримышечно 1 раз в сутки ежедневно на протяжении 10 дней. Курсовая доза составила 750 мг. Исследования иммунного статуса проводили до начала терапии, а также сразу после окончания курса лечения, через 1, 3, 6 месяцев. Анализировали показатели Т-звена иммунитета, уровень ряда цитокинов (интерлейкина (ИЛ) – 1β, -2, -4, -6, -8, -10, фактора некроза опухолей-α (ФНО-α), интерферона-α и интерферона-γ (ИФН-α и -γ) в супернатанте культуральной взвеси лимфоидных клеток. В группы сравнения вошли 54 больных ХЛЛ, не получавших иммуномодулирующую терапию, и 31 здоровый житель региона.
Лимфоидные клетки выделяли из гепаринизированной венозной крови центрифугированием на градиенте плотности фиколл-верографин (1,077 г/л). Лимфоциты для исследований использовали в рабочей концентрации 2х106 в 1 мл. Культивирование клеток проводили в 96 луночных планшетах для иммунологических исследований при 37°C в СО2-инкубаторе в среде RPMI-1640 с добавлением 10%-ной телячьей эмбриональной сыворотки и 100 мкг/мл гентамицина. Для стимуляции клеток использовали фитогемагглютинин в концентрации 100мкг/мл культуральной взвеси. Продолжительность инкубации составляла 72 часа для ИФН-α и ИФН-g, а для остальных цитокинов – 24 часа.
Концентрацию цитокинов в супернатанте культуральной взвеси определяли в иммуноферментном анализе с использованием коммерческих наборов реагентов ООО «Вектор–Бест» (п. Кольцово Новосибирской области, Россия).
Определение поверхностных антигенных детерминант лимфоцитов (CD3+, CD4+, CD8+, CD16+) проводили в лимфоцитотоксическом тесте (P.I. Tarasaki et al., 1970 г.) с использованием специфических моноклональных антител (OOO «Сорбент» г. Москва).
Для статистической обработки полученных данных использовали пакет прикладных программ Microsoft Excel 2007. Достоверность различий полученных показателей подтверждали с помощью расчета непараметрического критерия U (Вилкоксона–Манна–Уитни).
Результаты и обсуждение
Проведена оценка иммунокорригирующего влияния Ферровира у 13 больных ХЛЛ: изучена динамика уровней ряда цитокинов, а также показателей Т-клеточного иммунитета. В ходе исследований нами получены следующие результаты (таблица 1).
Из представленных в таблице данных видно, что спонтанная продукция большинства цитокинов у больных ХЛЛ лимфоцитами крови снижена. Так, оказались низкими концентрации ФНО-α, ИЛ-1β, -4, -8, -10, ИФН-α, ИФН-g. При этом уровни ИЛ-2 и -6 имели тенденцию к повышению.
Для анализа способности лимфоцитов к синтезу цитокинов в ответ на антигенную стимуляцию было проведено их культивирование с фитогемагглютинином. Результаты исследований представлены в таблице 2.
Из полученных результатов следует, что сохранность цитокинсекретирующей функции лимфоидных клеток больных ХЛЛ наблюдалась только в отношении ИЛ-4 и -6. Остальные показатели в группе обследуемых больных имели достоверно более низкое значение по сравнению с данными здоровых лиц. Такие изменения в цитокиновом профиле больных ХЛЛ, вероятнее всего, связаны со снижением функциональной активности опухолевых клеток, составляющих основной пул мононуклеаров периферической крови.
Анализируя полученные данные, можно отметить, что при опухолях лимфатической системы, в частности, при ХЛЛ, имеется дисбаланс в синтезе цитокинов вследствие вовлечения в патологический процесс значительной часть цитокинпродуцирующих лимфоидных клеток.
Изменения в цитокиновом каскаде, наблюдаемые у больных ОЛС, оказывают влияние на все основные функции лимфоцитов, включая реализацию противовирусного иммунного ответа. Из данных таблицы 1 видно, что в культуре лимфоцитов содержание ИЛ-4, -6, -10 у больных ХЛЛ значительно превышало уровень ИЛ-2 и ИФН-g, в отличие от показателей группы здоровых лиц, что в основном связано с угнетением синтеза ИФН-g. При этом показатели, отраженные в таблице 2, свидетельствуют о сохранности цитокинсекретирующей функции лимфоидных клеток больных ХЛЛ, по сравнению с данными группы доноров крови, только в отношении ИЛ-4 и -6.
Происходящие в системе иммунорегуляторных пептидов изменения коррелировали с субпопуляционным составом лимфоидных клеток (таблица 3).
Из представленных в таблице 3 данных видно, что относительное содержание СD3+-, СD4+-, СD8+- и СD16+-лимфоцитов у больных ХЛЛ достоверно ниже аналогичных показателей группы сравнения.
Исходя из вышесказанного, особое значение приобретает состояние противовирусного иммунитета у больных ОЛС на фоне проведения полихимиотерапии (ПХТ). Для этих целей нами была отобрана группа больных ХЛЛ, получавшая в качестве сопроводительной терапии препарат Ферровир® (Р №000630/01 от 08.12.06, ЗАО ФП «Техномедсервис», Москва). Данный препарат относится к группе противовирусных средств с иммуномодулирующим эффектом. Ферровир® применялся внутримышечно 1 раз в сутки в курсовой дозе 750 мг. Для оценки иммуномодулирующего действия препарата проведен анализ динамики некоторых показателей цитокинового и иммунного статуса. В супернатанте культуры мононуклеаров крови после терапии Ферровиром определяли содержание исследуемых цитокинов (таблица 4).
Полученные результаты свидетельствовали об изменении синтеза цитокинов мононуклеарами крови больных ХЛЛ на фоне применения Ферровира, в частности, наблюдалось повышение секреции ФНО-α и снижение уровней ИЛ-1β и -6.
Некоторые авторы в своих исследованиях указывают на способность ФНО-α индуцировать синтез ИЛ-1β и -6 моноцитами крови. В нашем случае данная тенденция не прослеживается. Снижение уровня ИЛ-6 у больных ХЛЛ могло свидетельствовать об уменьшении активности Т-хелперов 2 типа, что явилось, скорее всего, позитивным фактором реализации противовирусного иммунитета и динамики опухолевого процесса.
Для изучения ответа мононуклеарных клеток крови на антигенную стимуляцию по окончании курса терапии Ферровиром была проведена оценка синтеза цитокинов после культивирования лимфоидных элементов с фитогемагглютинином (таблица 5).
В отличие от спонтанной продукции цитокинов, наблюдалось снижение уровня ИЛ-2.
Следовательно, полученные в ходе исследования данные позволили предположить наличие у Ферровира цитокинмодулирующей активности, направленной на активацию противовирусного звена иммунитета даже в случаях лимфоидных опухолей.
Для выявления возможной взаимосвязи между изменениями показателей цитокинового профиля и количеством иммунокомпетентных клеток проведен анализ субпопуляционного состава лимфоцитов после курса терапии Ферровиром (таблица 6).
Из представленных в таблице 6 данных видно, что количество лимфоцитов, несущих определенный маркер у пациентов до лечения и после окончания терапии не имели значимых отличий. При этом наблюдалась тенденция к росту числа СD3+-лимфоцитов и естественных киллерных клеток. При обследовании пациентов через месяц отмечено достоверное увеличение относительного числа СD3+-и СD4+-лимфоцитов. К третьему месяцу содержание данных клеток снижалось и приближалось к значениям, выявленным сразу после окончания терапии. Следующий пик роста количества СD3+- и СD4+-лимфоцитов наблюдался через 6 месяцев и, возможно, был связан с тропностью Ферровира к лимфоидной ткани и последующей элиминацией эндолимфатическим путем к органам-мишеням.
Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что у больных ХЛЛ имеются изменения цитокинового профиля со смещением баланса иммунорегуляторных пептидов, соответствующих активности Т-хелперов 2 типа. У пациентов отмечено уменьшение относительного содержания СD3+-, СD4+-, СD8+- и СD16+-лимфоцитов. В комплексе подобные изменения свидетельствовали о снижении противовирусной защитной реакции организма. Результаты, полученные при применении препарата Ферровир у иммунокомпрометированных лиц, подтвердили приведенные в литературе данные о том, что препарат оказывает влияние на реализацию противовирусного ответа. У больных ХЛЛ данный противовирусный эффект заключался в виде модуляции цитокинового профиля и Т-звена иммунитета.
