Использование PRAME в диагностике меланоцитарных образований

Таблица 1. Критерии оценки экспрессии маркера PRAME в меланоцитарных образованиях

Таблица 2. Предложенная Olds H. и соавт. [5] методика оценки экспрессии PRAME в образованиях, ассоциированных с повышенным уровнем инсоляции

Рис. 1.1. Метастаз беспигментной эпителиоидноклеточной меланомы в лимфатическом узле (H&E, ×200)

Рис. 1.2. Экспрессия маркера PRAME (×200)

Рис. 2.1. Злокачественное лентиго (H&E, ×100)

Рис. 2.2. Злокачественное лентиго (PRAME, ×100)

Рис. 3.1. Простое солярное лентиго (H&E, ×100)

Рис. 3.2. Простое солярное лентиго (PRAME, ×100), внутренний позитивный контроль – мембранно-цитоплазматическая экспрессия в себоцитах сальных желез (красная стрелочка)

Рис. 4.1. Образование по типу пятна на коже плечевой области

Рис. 4.2. Дерматоскопическая картина

Рис. 4.3.1. Отсутствие созревания, образование периферического «плеча» (H&E, ×100)

Рис. 4.3.2. Цитологическая и ядерная атипия (H&E, ×100)

Рис. 4.3.3. Митотическая активность (H&E, ×200)

Рис. 4.4. Гетерогенная экспрессия PRAME (×100)

Рис. 5.1. Образование на коже спины по типу узла

Рис. 5.2. Смешанно-клеточная пигментная меланома кожи в стадии вертикального роста (H&E, ×100)

Рис. 5.3. Экспрессия р16 (×400)

Рис. 5.4. «Пятнистая» экспрессия HMB45 (×100)

Рис. 5.5. Высокая пролиферативная активность Ki67 (×400)

Рис. 5.6. Негативная экспрессия PRAME (×400)

Рис. 5.7. Экспрессия PRAME в единичных меланоцитах юнкциональной зоны (×400)

Рис. 6.1.1. Эпителиоидноклеточная малопигментная меланома анального канала, инвазивный рост (H&E, ×50)

Рис. 6.1.2. Эпителиоидноклеточная малопигментная меланома анального канала, фокусы компонента меланомы in situ (H&E, ×200)

Рис. 6.2.1. Эпителиоидноклеточная малопигментная меланома анального канала, диффузная экспрессия PRAME (×100)

Рис. 6.2.2. Эпителиоидноклеточная малопигментная меланома анального канала, диффузная экспрессия PRAME в пределах компонента in situ (×200)

Введение

PRAME (PReferentially expressed Antigen in MElanoma) – опухоль-ассоциированный антиген, впервые выявленный путем клонирования аутологичного эпитопа Т-клеток у пациентов с метастатической меланомой кожи. Нативная экспрессия PRAME в клетках здоровых органов крайне ограничена и представлена интактными тканями яичка, яичника, плаценты, эндометрием и надпочечниками. Помимо кожной меланомы, впоследствии экспрессия данного маркера была обнаружена в увеальной меланоме, а также в некоторых других немеланоцитарных опухолях: синовиальной саркоме, немелкоклеточном раке легкого, почечно-клеточном раке, миксоидной липосаркоме и др. [1].

В то время как «золотым стандартом» морфологической диагностики меланоцитарных образований остается исследование срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, иммуногистохимия остается важным вспомогательным методом диагностики, особенно в спорных случаях. Использование такого маркера, как PRAME, в ряде зарубежных исследований [1–3] продемонстрировало достаточную эффективность в диагностике меланом различных локализаций, в т.ч. и метастатического генеза. По данным мировой литературы, от 83,2% до 94% первичных кожных меланом неверетеноклеточной морфологии демонстрируют диффузную экспрессию PRAME, в то время как большинство невусов (86%) негативны по данному маркеру [1–3]. Внутри кластера меланом различных кожных локализаций способность к экспрессии PRAME наблюдалась у 94,4% акральных меланом, 92,5% поверхностно-распространяющихся меланом, 90% узловых меланом, 88,6% меланом по типу злокачественного лентиго, 35% десмопластических меланом [1]. Помимо этого, позитивны по экспрессии PRAME до 87% метастатических меланом. Также в ряде зарубежных исследований установлена прямая корреляция между результатами молекулярно-генетического FISH – исследования с определением копийности генов RREB1/MYB/CEP6/CCND1 и иммуногистохимической экспрессии маркера PRAME. В частности, были установлены конкордантность результатов описанных исследований в 90% случаев и конкордантность между результатами иммуногистохимического исследования и окончательного диагноза в 92,7% [2].

Все вышеперечисленное демонстрирует потенциальную перспективность использования PRAME в качестве вспомогательного диагностического маркера в ряде дискутабельных случаев. В нашем исследовании была поставлена цель проанализировать экспрессию маркера PRAME в ряде различных меланоцитарных образований, а также сопоставить полученные финальные результаты с данными мировой литературы.

Материал и методы

В ходе исследования проанализированы 33 случая, включающих в себя как первичные меланоцитарные новообразования кожи и анального канала, так и метастазы меланомы. Первичные образования включали в себя: невусы различных локализаций и морфологий, солярное лентиго, злокачественные лентиго, поверхностно-распространяющиеся меланомы, меланому анального канала, акральную меланому.

Все проведенные иммуногистохимические реакции были поставлены с использованием Anti-PRAME Rabbit Monoclonal Primary Antibody (mAb EPR20330; Abcam, #219650) на платформе Ventana BenchMark ULTRA system с системой визуализации (ultraView Universal Alkaline Phosphatase Red Detection Kit и UltraView Universal DAB Detection Kit). В качестве внутреннего контроля расценивалась мембранно-цитоплазматическая экспрессия в себоцитах сальных желез.

Оценка результатов каждого случая проводилась коллегиально с участием трех врачей-патологоанатомов.

Критерии оценки экспрессии PRAME

Критерием оценки уровня экспрессии маркера PRAME была выбрана система, предложенная C. Lezcano и соавт. [1] (табл. 1).

Обоснованием выбора является то, что большинство опухолей с окрашиванием 1+ показали редкие, случайно распределенные позитивные ядра, в то время как большинство опухолей с окрашиванием 4+ демонстрировали практически тотальную положительную экспрессию.

В некоторых случаях, где опухоль демонстрировала выраженную гетерогенность по PRAME, результат считался положительным при наличии как минимум двух смежных полей зрения (×400) диффузного уровня экспрессии (не менее 75% клеток с ядерным окрашиванием) [4]. При этом общий процент окрашивания клеток опухоли мог быть менее 75%. Согласно Alomari A.K. и соавт., описанный паттерн экспрессии рассматривался как позитивный [4]. Оценка экспреcсии PRAME в случаях образований, ассоциированных с повышенным уровнем инсоляции, в т.ч. злокачественного лентиго, производилась по методу, предложенному Olds H. и соавт. [5] (табл. 2).

Оценка краев резекции в случаях злокачественного лентиго является крайне неоднозначным вопросом, представляющим определенные диагностические трудности. Наиболее утилитарным авторы статьи расценили метод, предложенный Gradecki S.E. и соавт. Упомянутые авторы определяли позитивный край резекции следующим образом: «грязным» край резекции считался в том случае, если в его пределах отмечалось два и более подряд расположенных меланоцита с позитивной ядерной экспрессией PRAME. Единичные редкие или дискретно расположенные клетки с экспрессией PRAME не рассматривались в качестве позитивного края по злокачественному лентиго, так как такой паттерн экспрессии ранее был отмечен в 15% случаев солнечного лентиго [6].

Оценка экспрессии маркера PRAME в меланомах аноректальной зоны остается дискутабельной вследствие отсутствия достаточного количества материалов литературы, а также редкости заболевания.

Результаты

Очевидные случаи

В данном исследовании было проанализировано 14 первичных меланом различных локализаций, 12 из которых демонстрировали яркую (4+) диффузную (более 75% клеток) экспрессию маркера PRAME, что коррелировало с данными светооптического исследования. Таким образом, 85,7% исследованных первичных злокачественных меланоцитарных образований оказались PRAME-позитивными. Также было исследовано 15 невусов, в т.ч. невус Шпиц и невус особой локализации (молочная железа), показавших негативную экспрессию по маркеру PRAME. В четырех из четырех (100%) описанных случаев метастатической меланомы наблюдалась диффузная экспрессия PRAME 4+ более чем в 75% клеток опухоли (рис. 1.1 и 1.2).

Солярное лентиго vs злокачественное лентиго

Одной из потенциально трудных областей диагностики меланоцитарных опухолей кожи остается дифференциальная диагностика злокачественного лентиго и доброкачественных образований, ассоциированных с повышенным уровнем солярного повреждения, в частности солярного лентиго. Хроническая инсоляция вызывает увеличение количества эпидермальных меланоцитов, что в некоторых случаях затрудняет диагностику злокачественного лентиго. В ходе исследования было проанализировано три случая, два из которых по результатам сочетания рутинного светооптического исследования с иммуногистохимическим окрашиванием антителом PRAME представлены солярным лентиго и один случай – злокачественным лентиго.

Случай № 1

Пациентка М., 57 лет, рецидивирующее пигментное образование крыла носа по типу пятна с нечеткими, неровными контурами. Произведена панч-биопсия. В пределах срезов, окрашенных гематоксилин-эозином, в базальном слое определяется скопление клеток, подозрительных на меланоцитарные, в одном из кусочков – небольшие гнездные скопления невоидных клеток (рис. 2.1). При проведении иммуногистохимического исследования с маркером PRAME определяется диффузное окрашивание интенсивностью 4+ примерно в 63 клетках на протяженности 1 мм, расцененное авторами статьи как злокачественное лентиго. Полученный результат согласуется с литературными данными и вышеприведенным предложенным методом оценки уровня экспрессии (рис. 2.2) [5].

Случай № 2

Пациентка Г., 67 лет, слабопигментное образование по типу пятна на скуловой области. Произведена панч-биопсия. По результатам рутинного светооптического исследования определяются единичные, дискретно расположенные, несколько увеличенные в размерах меланоциты в пределах юнкциональной зоны (рис. 3.1). Результаты иммуногистохимического исследования с маркером PRAME (рис. 3.2) демонстрируют аберрантную цитоплазматическую экспрессию в базальных пигментных кератиноцитах и ядерную экспрессию интенсивностью 4+ в юнкциональных меланоцитах, количество которых составляет шесть клеток на протяжении 1 мм, что расценивается авторами статьи как простое солярное лентиго.

Случаи с неоднозначной экспрессией PRAME

Случай № 3

Пациентка К., 65 лет, образование по типу пятна на коже плечевой области, 4 × 3 мм (рис. 4.1). По данным дерматоскопии было вынесено заключение о неопределенном потенциале злокачественности образования (рис. 4.2). По данным светооптического исследования срезов, окрашенных гематоксилин-эозином (рис. 4.3), принадлежность опухоли к слабопигментной поверхностно-распространяющейся эпителиоидноклеточной меланоме не вызывает сомнений. Определялись отсутствие вертикального созревания клеток, цитологическая и ядерная атипия, выраженный полиморфизм клеток по периферии опухоли, митотическая активность. Однако уровень экспрессии PRAME демонстрирует гетерогенность по интенсивности окрашивания: от 1+ до 4+ (рис. 4.4). В данном случае авторы исследования использовали вышеприведенный метод оценки гетерогенной экспрессии PRAME и расценили приведенный на рис. 4.4 паттерн экспрессии в качестве позитивного.

Случай № 4

Пациентка Б., 66 лет, образование на коже спины по типу узла, 4 х 4 мм (рис. 5.1). Светооптически (рис. 5.2), а также с учетом проведенного иммуногистохимического исследования с маркерами р16 (негативная реакция, рис. 5.3), HMB45 (неравномерная «пятнистая» экспрессия без признаков градиентности, рис. 5.4), повышенного индекса пролиферации Ki67 (до 35% в hot spots, рис. 5.5) окончательный диагноз – слабопигментная смешанно-клеточная меланома кожи в стадии вертикального роста. Образование показывает отсутствие убедительной экспрессии маркера PRAME с учетом неоднократных ротаций иммуногистохимического исследования (рис. 5.6). Однако определяется экспрессия в меланоцитах юнкциональной зоны (рис. 5.7), что не расценивалось авторами статьи в качестве диагностически значимого критерия.

Меланома анального канала

Меланома анального канала – редкое заболевание, составляющее 0,05% всех злокачественных ново­образований колоректальной области и 0,3% всех меланом [7].

В ходе данного исследования авторы статьи проанализировали случай изъязвленной меланомы прямой кишки в узловой стадии роста.

Случай № 5

Пациентка Г., 65 лет, с наличием образования диаметром около 1 см по задней стенке прямой кишки на 3 см от анального канала. Выполнено трансанальное удаление опухоли.

В пределах гистологических препаратов, окрашенных гематоксилин-эозином, определяется рост опухоли, имеющей строение инвазивной эпителио­идноклеточной малопигментной меланомы (рис. 6.1.1). Также определяются фокусы лентигинозного роста меланомы in situ (рис. 6.1.2). По данным иммуногистохимического исследования, диффузная (более 75% опухолевых клеток) экспрессия PRAME как в пределах инвазивного компонента, так и в пределах лентигинозной меланомы in situ (рис. 6.2.1; рис. 6.2.2), что потенциально расширяет области применения данного маркера.

Заключение

Иммуногистохимическое исследование с маркером PRAME продемонстрировало достаточную эффективность в качестве метода вспомогательной диагностики меланоцитарных образований различного генеза и локализаций. Несмотря на это, остаются случаи, в которых уровень наблюдаемой экспрессии расходится с ожидаемым и остается дискутабельным. В рамках нашего исследования было проанализировано 33 случая меланоцитарных образований как первичного, так и метастатического генеза. В двух случаях наблюдалось тотальное отсутствие экспрессии PRAME в образованиях, чья принадлежность к меланоме не вызывает сомнений и диагностируется на светооптическом уровне. Еще в трех образованиях, светооптически также расцененных как злокачественные, клетки опухоли демонстрировали выраженную гетерогенность экспрессии PRAMЕ. Проанализировав полученные результаты, можно сделать вывод, что 84,8% всех исследованных меланом демонстрировали диффузную яркую экспрессию маркера PRAMЕ, в то время как 100% невусов были негативны по этому маркеру. Таким образом, полученные в ходе исследования результаты соотносятся с данными мировой литературы.

Несмотря на тот факт, что в большем проценте случаев результаты иммуногистохимического исследования с маркером PRAME успешно коррелировали с окончательным диагнозом, использование других антител (р16, HMB45, Ki67), а также применение молекулярно-генетических методов не теряет своей актуальности.