Новые возможности использования комбинации лазерных технологий Aerolase Nd:YAG 1064 нм MicroPulse и Er:YAG 2940 нм при омоложении кожи лица

Первичные антитела, использованные для ИГХ-исследования

Рис. 1. Гистологическая картина у пациентки К. до и после лазерной терапии (А, Б – окрашивание ГЭ, В – окрашивание В-Г)

Рис. 2. Иммуногистохимическое исследование у пациентки К. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 3. Гистологическая картина у пациентки С. до и после лазерной терапии (А, Б – окрашивание ГЭ, В – окрашивание по В-Г)

Рис. 4. Иммуногистохимическое исследование у пациентки С. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 5. Гистологическая картина у пациентки В. до и после лазерной терапии (А, Б – ГЭ, В – В-Г)

Рис. 6. Иммуногистохимическое исследование у пациентки В. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 7. Гистологическая картина у пациентки Т. до и после лазерной терапии (А, Б – ГЭ, В – В-Г)

Рис. 8. Иммуногистохимическое исследование у пациентки В. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 9. Гистологическая картина у пациентки Ш. до и после лазерной терапии (А, Б – ГЭ, В – В-Г)

Рис. 10. Иммуногистохимическое исследование у пациентки Ш. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 11. Гистологическая картина у пациентки А. до и после лазерной терапии (А, Б – ГЭ, В – В-Г)

Рис. 12. Иммуногистохимическое исследование у пациентки А. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Рис. 13. Гистологическая картина у пациентки С. до и после лазерной терапии (А, Б – ГЭ, В – В-Г)

Рис. 14. Иммуногистохимическое исследование у пациентки С. до и после лазерной терапии (А – коллаген I типа, Б – коллаген III типа)

Старение является многофакторным биологическим процессом метаболических и структурно-функциональных изменений организма, который охватывает все органы и ткани человека. Старение – часть необратимых биологических процессов, которые происходят в организме, их обусловливают генетические нарушения, сокращение теломер, устойчивость клеточных структур к окислительному повреждению, а также агрессивное воздействие внешней среды [1, 2]. На интенсивность изменений влияет группа факторов, которые непосредственно не связаны с возрастом: эндокринные расстройства, психологические травмы, передозировка ультрафиолетового и рентгеновского излучений, значительные колебания массы тела, неблагоприятная экология, вредные условия работы и ряд других факторов [2]. В результате действия этих факторов формируются различные гистоморфологические и физиологические механизмы, которые влияют на характер, степень, скорость развития изменений различных структур кожи.

Свойства и функции кожи, ее придатков ухудшаются с возрастом: кожа теряет влагу, способность к регенерации, истончается, нарушаются процессы кератинизации, пигментации, удержания влаги, кровообращения, синтеза коллагена и т.д. [3].

Широкий выбор методов воздействия на современном этапе развития косметологии и физиотерапевтических методов позволяет подбирать индивидуальные программы с учетом особенности кожи и бюджета.

В настоящее время все большую популярность приобретает так называемое дермальное омоложение кожи. Под этим термином понимают реструктуризацию дермы с резким возрастанием количества коллагена I и III типов и изменение перфузии тканей вследствие нормализации работы микроциркуляторного русла. Для получения указанных эффектов, как правило, используются различные лазеры.

Лазеры, обычно используемые для омоложения, можно разделить на аблятивные и неаблятивные – и те и другие могут быть фракционными [4]. Традиционно аблятивные лазеры, такие как углекислотный (CO₂, 10 600 нм) или эрбиевый (Er:YAG, 2490 нм), считаются более эффективными, чем неаблятивные устройства [5, 6]. Однако после лазерной процедуры для восстановления кожи необходимо длительное время и существует большая вероятность осложнений [7]. Чтобы минимизировать эти осложнения, была внедрена технология фракционирования [8]. Er:YAG-лазеры удаляют избыток ткани, не вызывая значительного бокового теплового нагрева [5]. По сравнению с фракционным CO₂ фракционный Er:YAG-лазер обеспечивает аналогичную эффективность с более удовлетворительным профилем безопасности [6]. В то же время для омоложения кожи используются неаблятивные устройства [7–10]. Например, короткоимпульсный неодимовый лазер на иттрий-алюминиевом гранате (Nd:YAG) с длиной волны 1064 нм может доставлять энергию в глубокие слои дермы, что приводит к ремоделированию коллагена и эластина с минимальным периодом реабилитации или вообще без него и с меньшим дискомфортом для пациента [7]. Кроме того, лазерные импульсы Nd:YAG слабо поглощаются меланином, что позволяет проводить более безопасное лазерное лечение у пациентов с любым фототипом кожи [8].

Таким образом, сочетанное применение Er:YAG- и Nd:YAG-лазеров наиболее предпочтительно для достижения максимального эффекта реструктуризации кожи.

С целью изучения эффективности сочетанного применения Er:YAG- и Nd:YAG-лазера на базе клиники «Лорексиния» и поликлиники № 2 Управления делами Президента РФ было проведено исследование с участием 25 женщин-добровольцев с инволютивными изменениями кожи лица и шеи в возрасте от 38 до 61 года. Средний возраст – 49 ± 3,7 года. Всем пациенткам провели комплексную процедуру с использованием аппарата Aerolase Er:YAG 2940 нм и Aerolase Nd:YAG 1064 нм MicroPulse. Семи пациенткам взяли панч-биопсию кожи до и после проведенных процедур из места воздействия.

Процедуру комплексного омоложения лица проводили в два этапа: на первом выполняли лазерный пилинг с помощью аппарата Aerolase Er:YAG 2940 нм. Воздействие осуществлялось расфокусированным лазерным лучом с длиной волны 2940 нм, длительностью импульса 0,3 мс, энергией в импульсе 0,6 Дж, площадью пятна до 1 см², что способствовало снижению плотности энергии ниже пороговых для абляции значений. Это, в свою очередь, позволило при сохранении фотобиологических эффектов в виде стягивания и уплотнения кожи, улучшения ее фотооптических свойств добиться вместо абляции мягкой смены поверхностных слоев кожи в виде крупнопластинчатого шелушения с улучшением ее рельефа. Также вследствие субкоагуляционного лазерного нагрева кожи произошла активация белков теплового шока, приводящая к запуску процесса неоколлагеногенеза.

На втором этапе использовали методику Aerolase Nd:YAG 1064 нм MicroPulse, что позволило добиться двух следующих эффектов:

1. При воздействии лазерным лучом с длиной волны 1064 нм, длительностью импульса 0,65 мс, энергией в импульсе 3 Дж и диаметром пятна 0,2 см были достигнуты мелкоточечная коагуляция сосудов дермы и коагуляционно-денатурационные изменения в дерме (разрушение «старого» коллагена). Так как основным хромофором для излучения с длиной волны 1064 нм является гемоглобин, то фактор разрушения микроциркуляторного русла запускает неоангиогенез, существенно меняя суммарную перфузию тканей, что и является дополнительным пусковым фактором омоложения.
2. Далее, с увеличением энергии импульса до 6 Дж и диаметра пятна до 0,5 см, был достигнут субкоагуляционный лазерный нагрев кожи, что простимулировало ответ тканей на тепловой шок, который проявляется временным изменением в метаболизме клеток. Образующиеся в результате лазерного воздействия белки теплового шока запускают реакции местного иммунитета в виде асептического воспаления. Итогом процедуры является запуск процесса неоколлагеногенеза с преобладающим синтезом коллагена I и III типов при явном увеличении количества коллагена I типа. Клинический результат связан с увеличением плотности и толщины дермы, восстановлением механических свойств кожи.

С целью объективизации результатов исследования до и через месяц после процедуры у пациенток были взяты биоптаты из височной, шейной, околоушной областей. Для гистологического исследования изготовляли срезы толщиной 4–6 мкм, которые окрашивали гематоксилином (ГЭ) и эозином по методу Ван Гизона (В-Г). Для иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания были выполнены серийные срезы толщиной 4–6 мкм, которые помещали на предметные стекла, покрытые поли-L-лизином (Menzel). Исследования проводили на депарафинизированных и дегидратированных срезах с использованием авидин-биотинового иммунопероксидазного метода.

Для верификации экспрессии использовали первичные антитела (таблица).

Полученные микропрепараты сканировали с применением сканера препаратов Leica Aperio AT2 с последующим анализом с использованием программного обеспечения Aperio ImageScope.

При исследовании маркеров определяли относительную площадь экспрессии. Для подсчета анализировали как минимум пять полей зрения на увеличении × 40 с измерением относительной площади экспрессии. Относительную площадь экспрессии рассчитывали как отношение площади экспрессии маркера к площади исследуемой ткани.

Клинические случаи

Пациентка К., 42 года. До лечения в гистологическом препарате был виден эпидермис с очагами гиперкератоза и акантоза, фокусы с формированием роговых кист. Сосочковая дерма состояла из рыхлого, тонкого коллагена с очагами уплотнения в зоне придатков кожи. Визуализировались спавшиеся сосуды, единичные расширенные артериолы со слабой лимфоцитарной инфильтрацией, единичные лимфатические капилляры и свободно лежащий пигмент, а также обилие сальных желез. Дерма представлена рыхлыми, тонкими волокнами соединительной ткани (розовые) и малым количеством эластических волокон (желтые) (рис. 1).

После терапии гистологическая картина изменилась: в эпидермисе были выявлены небольшое количество меланоцитов и свободно лежащий пигмент в дерме, а также отмечены расширение лимфатических сосудов и минимальные изменения артериального русла. Перивазально определялся умеренный лимфоцитарный инфильтрат. При окраске по В-Г дерма была представлена рыхлым коллагеном с увеличением плотности в зоне придатков, эластические волокна заметны в небольшом количестве. В верхней дерме волокна укрупнились, приобретая более выраженное параллельное расположение.

По результатам сравнения образцов отмечены слабая перивазальная воспалительная реакция и уплотнение коллагена в дерме с большей параллельной ориентацией пучков (рис. 2).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 59,52, после – 54,19; коллагена III типа до лечения – 5,83, после – 7,65. При сравнении площадей экспрессии коллагена I и III типов до и после воздействия статистически значимой разницы не было выявлено (p > 0,05).

Пациентка С., 61 год. У пациентки выявлены комбинированный тип кожи, жирность в Т-зоне, фототип II, рельеф ровный, выраженный гиперкератоз.

До лечения в гистологическом препарате был виден эпидермис с гиперкератозом, очагами акантоза, единичные меланоциты с пигментом. Средняя дерма содержала очаги плотного коллагена с фрагментацией; волосяные фолликулы; мышцу, поднимающую волос и сальные железы типового строения; потовые железы с липоматозом; сосуды, представленные полнокровными артериями и лимфатическими капиллярами. При окраске по В-Г в верхней дерме плотный зрелый коллаген (красный) с фрагментацией. Средняя дерма представлена рыхлыми, тонкими и средними волокнами соединительной ткани (розовые) и единичными эластическими волокнами (желтые). После терапии при окраске по В-Г в верхней дерме были заметны рыхлый тонкий коллаген, разволокнение; в глубоких слоях определялась гладкомышечная пролиферация; эластических волокон было выявлено небольшое количество (рис. 3).

При сравнении образцов отмечены более выраженная грубая коллагенизация и небольшие изменения в сосудистом русле в виде расширения просвета (рис. 4).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 49,43, после – 75,8, коллагена III типа до лечения – 1,24, после – 5,08. При сравнении площадей экспрессии коллагена I и III типов до и после воздействия была выявлена статистически значимая разница (p < 0,05).

Пациентка В., 38 лет. У пациентки выявлен нормальный тип кожи, фототип II, рельеф ровный, фолликулярный гиперкератоз в Т-зоне.

До лечения в гистологическом препарате был виден эпидермис типового строения. Средняя дерма рыхлая, содержала волосяные фолликулы; мышцу, поднимающую волос;  сальные и потовые железы. Сосочковая и верхняя дерма была представлена рыхлой соединительной тканью с небольшим количеством сосудов; просветы округлые; единичные лимфатические капилляры с узким просветом. При окраске по В-Г дерма была представлена рыхлыми, тонкими и средними волокнами соединительной ткани (розовые) и многочисленными эластическими волокнами (желтые). После воздействия лазером при окраске по В-Г дерма также была представлена рыхлыми, тонкими и средними волокнами соединительной ткани (розовые) и немногочисленными эластическими волокнами (желтые), ход волокон хаотичный (рис. 5).

При сравнении образцов между собой значимых отличий выявлено не было (рис. 6).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 65,67, после – 82,40, коллагена III типа до лечения – 3,10, после – 2,08. При сравнении площадей экспрессии коллагена I и III типов до и после воздействия лазером была выявлена статистически значимая разница (p < 0,05).

Пациентка Т., 39 лет. У пациентки выявлен нормальный тип кожи, фототип II, рельеф ровный. До лечения в гистологическом препарате был виден эпидермис типового строения. Верхняя дерма рыхлая, средняя дерма содержала волосяные фолликулы; мышцу, поднимающую волос; обилие сальных желез. Окружающая дерма была представлена плотными, крупными пучками соединительной ткани; единичными лимфатическими капиллярами с широким просветом; просвет сосудов узкий. При окраске по В-Г до и после терапии дерма была представлена толстыми, крупными волокнами соединительной ткани; эластических волокон было выявлено небольшое количество (рис. 7).

При сравнении образцов между собой определяются незначительные изменения лимфатических сосудов с их расширением и появление лимфоцитарной инфильтрации со сгущением инфильтрата в зоне сальных желез (рис. 8).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 69,04, после – 85,06, коллагена III типа до лечения – 1,81, после – 3,06. При сравнении площадей экспрессии коллагена I и III типов до и после воздействия была выявлена статистически значимая разница (p < 0,05).

Пациентка Ш., 59 лет. У пациентки выявлен нормальный тип кожи, склонной к сухости, фототип II, рельеф ровный. До лечения в гистологическом препарате был виден эпидермис типового строения, содержащий несколько волосяных фолликулов и небольшое количество сальных желез. Сосочковая и верхняя дерма представлена рыхлой соединительной тканью с небольшим количеством сосудов, просветы расширены, единичные – зияют. Средняя дерма содержала крупный коллаген и умеренный лимфоцитарный инфильтрат, расположенный вокруг фолликулов. При окраске по В-Г дерма была представлена толстыми, крупными волокнами соединительной ткани с умеренным количеством эластических волокон. Верхняя дерма рыхлая с преобладанием незрелого коллагена. После воздействия при окраске по В-Г в верхней и средней дерме наблюдалось чередование крупных и мелких волокон со значительным количеством эластических элементов (рис. 9).

При сравнении образцов отмечено исчезновение воспаления, дерма содержала большое количество эластических волокон и коллагеновых волокон крупного и среднего размера, распределенных равномерно (рис. 10).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 51,45, после – 68,7, коллагена III типа до лечения – 1,42, после – 3,43.

При сравнении площадей экспрессии до и после воздействия выявлены статистически значимые различия (p < 0,05) в площади экспрессии коллагена I и III типов.

Пациентка А., 45 лет. У пациентки выявлен жирный тип кожи, фототип II, рельеф ровный, выраженный диффузный и фолликулярный гиперкератоз.

До лечения в гистологическом препарате была заметна тонкая кожа, эпидермис типового строения с ороговением. Сосочковая и верхняя дерма была представлена рыхлой соединительной тканью с небольшим количеством сосудов, просветы закрыты, единичные – зияли. Средняя дерма была рыхлая, содержала волосяные фолликулы и сальные железы с признаками гиперсекреции. При окраске по В-Г дерма была представлена рыхлыми, тонкими волокнами соединительной ткани (розовые) и эластическими волокнами (желтые). После воздействия лазера при окраске по В-Г в сосочковой дерме выявлялся зрелый коллаген (красный), формирующий толстые пучки (рис. 11).

При сравнении образцов определялись значительные изменения лимфатических сосудов с их расширением и появление лимфоцитарной инфильтрации, а также укрупнение волокон коллагена в верхней дерме (рис. 12).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 81,6, после – 82,63, коллагена III типа до лечения – 3,74, после – 9,23.

При сравнении площадей экспрессии до и после воздействия лазера выявлены статистически значимые различия (p < 0,05) в площади экспрессии коллагена III типа и не выявлены (p > 0,05) в площади экспрессии коллагена I типа.

Пациентка С., 47 лет. У пациентки выявлен сухой тип кожи, фототип II, рельеф ровный.

До лечения в гистологическом препарате был заметен эпидермис с очагами гиперкератоза, наблюдались очаги акантоза, небольшое количество сальных и потовых желез. Верхняя дерма была рыхлая, небольшое количество расширенных сосудов, лимфатические капилляры узкие. Средняя дерма была рыхлая, содержала небольшое количество крупных волокон.

При окраске по В-Г были заметны немногочисленные крупные волокна с хаотичным расположением, умеренное количество эластических волокон и тонкого коллагена. После воздействия при окраске по В-Г крупные волокна чередовались с эластическими волокнами и мелкими волокнами коллагена (рис. 13).

При сравнении препаратов до и после наблюдались изменения в лимфатических капиллярах с их резким расширением. Увеличено количество эластических волокон, и крупные коллагеновые пучки приобрели правильное и равномерное распределение (рис. 14).

Средняя площадь экспрессии коллагена I типа до лечения составила 70,06, после лечения – 72,24; коллагена III типа до лечения – 5,50, после – 11,15.

При сравнении площадей экспрессии до и после воздействия лазера выявлены статистически значимые различия (p < 0,05) в площади экспрессии коллагена III типа и не выявлены (p > 0,05) – в площади экспрессии коллагена I типа.

Заключение

Таким образом, при сравнении площадей экспрессии коллагена I типа получены статистически значимые результаты у четырех из семи пациенток, при сравнении площадей экспрессии коллагена III типа получены статистически значимые результаты у шести из семи пациенток. Максимальные изменения экспрессии коллагена I и III типов получены у более молодых пациенток, из чего следует, что для профилактики старения кожи проведение процедур лазерного омоложения кожи следует начинать с 35 лет. Однако даже у пациентки, у которой не получено статистически значимых результатов изменения площадей экспрессии коллагена I и III типов, при гистологическом исследовании наблюдается улучшение качества кожи: расширение сосудов лимфатического и артериального русла, увеличение плотности коллагена в зоне придатков кожи, в верхней дерме – укрупнение эластических волокон, более выраженное параллельное их расположение.

Представленная методика позволяет добиться оптической селективности, низкого рассеяния неодимового лазера, сокращения длительности импульса меньше времени термической релаксации сосудов и меланина кожи. Результаты гистологического исследования подтверждают правильность выбора оптимального сочетания длительности импульса 0,65 мс и частоты следования импульса (до 1,5 Гц), а также воздействия энергиями, достаточными для достижения коагуляции хромофора, что способствует сокращению реабилитационного периода и свидетельствует о безопасности и эффективности данной методики. Все вышеперечисленное позволяет рекомендовать разработанную комплексную методику для применения у пациентов различного возраста с инволютивными изменениями лица и шеи.