Молекулярные показатели клеток шейки матки в качестве диагностических маркеров цервикальной интраэпителиальной неоплазии третьей степени

Таблица 1. Характеристика диагностических маркеров на основании изучения спектра ВЖК в биоптатах шейки матки

Таблица 2. Характеристика диагностических моделей на основании изучения белков воспаления в цервикальном эпителии

Таблица 3. Характеристика диагностических моделей на основании изучения белков иммунного цикла в цервикальном эпителии

Рис. 1. ROC-анализ диагностических маркеров

Рис. 2. ROC-анализ диагностической значимости порога локальной величины B7.2

Введение

Рак шейки матки (РШМ) является одним из самых распространенных заболеваний в мире [1]. Актуальность проблеме придают контингент больных (сексуально активные, трудоспособные женщины), высокий показатель запущенности (в 2019 г. в России 33,4%), отсутствие доступа к вакцинации во многих странах, несовершенство скрининга, малоэффективное лечение рецидивирующих и генерализованных форм [1–4].

Цервикальная интраэпителиальная неоплазия (ЦИН) 3-й степени является предраковым заболеванием шейки матки. Речь прежде всего идет о цитоморфологической характеристике цервикального эпителия, определяющей степень интраэпителиальных неопластических изменений клеток шейки матки, а также критерии прогноза малигнизации цервикального эпителия. Как правило, ЦИН 1-й степени полностью регрессирует [5]. Между тем ЦИН 3-й степени в отсутствие лечения способна как регрессировать (30%), так и прогрессировать до инвазивного РШМ (30%). Кроме того, почти в 25% случаев ЦИН 3-й степени рецидивирует [6]. Риск прогрессирования ЦИН 3-й степени увеличивается при наличии следующих ко-факторов:

• использование оральных контрацептивов;
• курение;
• ранний возраст полового дебюта;
• наличие нескольких половых партнеров;
• наличие ко-инфекции;
• инфицирование несколькими штаммами вируса папилломы человека (ВПЧ);
• наличие остаточной опухоли после локального хирургического лечения [6–9].

Маршрутизация больных обусловлена степенью ЦИН. Если тактику ведения пациенток с ЦИН 1–2-й степени определяет гинеколог, то пациентки с ЦИН 3-й степени должны направляться в специализированное онкологическое учреждение, что продиктовано возможностью диагностики РШМ после дообследования. Согласно данным литературы, до 30% пациенток с первичным диагнозом ЦИН 3-й степени после дообследования переходят в категорию больных РШМ [6].

Метаанализ результатов 40 исследований был посвящен оценке эффективности ВПЧ-тестирования и цитологической диагностики в качестве инструментов цервикального скрининга. Объем выборки превысил 140 тыс. женщин в возрасте 20–70 лет. Чувствительность ВПЧ-тестирования в диагностике ЦИН 3-й степени была выше чувствительности цитологического скрининга в 1,46 раза (1,12–1,91), а специфичность ниже в 0,95 раза (0,93–0,97). Авторы подчеркнули, что использование только цитологического скрининга может привести к ошибкам диагностики и задержкам в получении адекватного лечения [10, 11]. Однако в настоящее время в большинстве регионов России ВПЧ-тестирование остается недоступной опцией.

В настоящее время актуальны исследования по определению новых молекулярных диагностических критериев, позволяющих выявить предопухолевый процесс с целью его своевременного лечения, а также предотвращения РШМ и его последствий. Ранее нами были установлены патофизиологические особенности спектра высших жирных кислот (ВЖК), сосудисто-воспалительных факторов и белков контрольных точек иммунного цикла у больных предопухолевыми заболеваниями и РШМ [12, 13].

Цель – определить информативность исследования молекулярных показателей цервикального эпителия в качестве диагностических маркеров ЦИН 3-й степени.

Материал и методы

Критериями включения пациенток в проспективное исследование были диагноз ЦИН 3-й степени, установленный морфологически, первичный статус заболевания до проведения специализированного лечения, репродуктивный возраст, отсутствие инфекций, передаваемых половым путем, и сопутствующей гинекологической патологии, наличие оформленного согласия больных.

Обследованы 12 пациенток с ЦИН 3-й степени. Средний возраст составил 30 ± 6,2 года. Объем диагностических исследований определяли на основании клинических рекомендаций Минздрава России «Цервикальная интраэпителиальная неоплазия, эрозия и эктропион шейки матки», утвержденных в 2020 г. Градация ЦИН проводилась с учетом соответствующей гистологической классификации на основании степени тяжести цервикального поражения.

Контрольную группу составили 15 женщин-добровольцев без гинекологической патологии. Пациентки контрольной и исследуемой групп были сопоставимы по возрасту и сопутствующей патологии.

Материалом для изучения служили:

• биоптат шейки матки, забранный под кольпоскопическим контролем путем ножевой инцизионной биопсии;
• цервикальный эпителий: соскоб по стандартной методике браш-щеточкой с зоны стыка эпителиев.

Применялись следующие методы исследования:

• газохроматографическое исследование ВЖК на хроматографе «Кристалл-2000М» (Россия) с использованием плазменно-ионизационного детектора и капиллярной колонки FFAP (США) (С_14:0, С_14:1, С_15:0, С_15:1, С_16:0, С_16:1, С_17:0, С_17:1, С_18:0, С_18:1, C_18:2ω6, C_18:3ω6, C_18:3ω3, С_19:0, С_20:0, C_20:3ω6, C_20:4ω6, C_20:5ω3, C_22:5ω3);
• проточная цитофлуометрия с использованием аппарата FC500 (Beckman Coulter, США). Определяли спектр сосудисто-воспалительных факторов в цервикальном эпителии: MG, MMP-2, CAL, LCN2, OPN, VCAM-1, SAA, MPO, IGFBP-4, ICAM-1, СС, MMP-9 – Human Vascular Inflammation Panel 1-S/P (12-plex) with Filter Plate (Канада). Изучали уровень белков контрольных точек иммунного цикла в цервикальном эпителии sCD25, 4-1BB, B7.2, TGF-b1, CTLA-4, PD-L1, PD-1, Tim-3, LAG-3, Galectin-9, sCD27, PD-L2 – HU Immune Checkpoint Panel 1 – S/P (10-plex) w/FP (Канада).

При проведении статистического анализа авторы руководствовались едиными требованиями для рукописей, подаваемых в биомедицинские журналы, и рекомендациями «Статистический анализ и методы в публикуемой литературе» (SAMPL) [14].

В ходе ROC-анализа для каждого исследуемого параметра первоначально определялось пороговое значение. В качестве независимых переменных использовались уровни молекулярных показателей, в качестве переменных отклика – клинические диагнозы, где 0 означал отсутствие цервикальной патологии, 1 – наличие ЦИН 3-й степени.

Относительно полученного порогового значения все изучаемые количественные переменные были преобразованы в номинальные величины. Номинальные величины сравнивали с помощью критерия χ² Пирсона. Для оценки силы связи использовали критерий Крамера (V). Учитывая проспективный анализ результативных и факторных признаков, значимость различий номинальных данных оценивали путем определения относительного риска. Статистическую значимость p оценивали исходя из значений 95%-ного доверительного интервала (ДИ).

Качество исследуемых диагностических маркеров оценивали на основании расчета чувствительности (Se), специфичности (Sp) и точности (Ac) по следующим формулам:

Информативность исследуемых маркеров оценивали по площади под ROC-кривой (AUC). Показатель AUC интерпретировали по экспертной шкале (с учетом 95% ДИ), согласно которой при значении, находящемся в пределах интервала 0,9–1,0, качество модели оценивается как отличное, 0,8–0,9 – очень хорошее, 0,7–0,8 – хорошее, 0,6–0,7 – среднее, 0,5–0,6 – неудовлетворительное.

Статистическую обработку результатов исследования осуществляли с помощью пакета программ IBM SPSS Statistics Version 25.0 (International Business Machines Corporation, license No. Z125-3301-14, США).

Результаты

Среди представителей насыщенных жирных кислот диагностической значимостью для выявления ЦИН 3-й степени характеризовались локальные величины: С_14:0 > 2,9% клетки, С_15:0 < 1,9%, С_16:0 ≥ 29,2%, С_17:0 > 2,45%, С_20:0 < 1,6% клетки. Максимальный риск для диагностики ЦИН 3-й степени 10,4 (95% ДИ 1,58–68,13) имел место у лиц с пороговым значением С_16:0 ≥ 29,2% клетки (Se = 0,92; Sp = 0,87; Ac = 0,89; AUC = 0,86) (табл. 1).

Среди моноеновых жирных кислот в группе выявленных диагностических маркеров максимальным диагностическим потенциалом характеризовалось пороговое значение С_15:1 ≥ 1,0% (Se = 1,0; Sp = 1,0; Ac = 1,0; AUC = 1,0), а также пороговое значение С_17:1 ≤ 2,2% (Se = 1,0; Sp = 1,0; Ac = 1,0; AUC = 1,0) (табл. 1).

Среди полиеновых аналогов наилучшим диагностическим значением для выявления предракового состояния шейки матки обладала низкая пороговая величина C_18:3ω6 < 2,5% (Se = 1,0; Sp = 1,0; Ac = 1,0; AUC = 1,0) (табл. 1).

При анализе диагностических возможностей каждого сосудисто-воспалительного фактора статистически значимые различия исследуемых групп были получены только для локальной величины VCAM-1: превышение значения VCAM-1 > 0,3 нг/мл сопровождалось увеличением риска наличия ЦИН 3-й степени до 5,5 раза (относительный риск 5,5; 95% ДИ 1,05–28,88; р = 0,04) (табл. 2).

Среди белков иммунного цикла диагностическим потенциалом для выявления ЦИН 3-й степени обладали локальные величины B7.2, PD-L1, sCD27, PD-L2 (табл. 3). Повышение пороговой величины B7.2, PD-L1, sCD27, PD-L2 ≥ 15 пг/мл (Se = 0,83; Sp = 0,73; Ac = 0,78; AUC = 0,77), > 6,0 пг/мл (Se = 0,83; Sp = 0,67; Ac = 0,74; AUC = 0,74), > 12,2 пг/мл (Se = 0,83; Sp = 0,73; Ac = 0,52; AUC = 0,74) и ≥ 18,3 пг/мл (Se = 0,67; Sp = 0,807; Ac = 0,63; AUC = 0,73) соответственно свидетельствует о наличии ЦИН 3-й степени. При этом наилучшим диагностическим маркером служит локальное значение B7.2 ≥ 15 пг/мл, что позволяет выявить ЦИН 3-й степени шейки матки в 83,3% случаев.

На следующем этапе была предпринята попытка выявить универсальный диагностический маркер для выявления ЦИН 3-й степени путем проведения ROC-анализа среди установленных лучших критериев (С_15:1, С_17:1, C_18:3ω6, VCAM-1, В7.2).

С учетом требований, предъявляемых к скринирующей методике (дешевизна, простота, неинвазивность, скорость выполнения методики), а также длительности хроматографического исследования, необходимости в наличии обученного персонала и оборудования, полноты анализа (исследуется весь спектр ВЖК), инвазивности методики (материал исследования – био­птат шейки матки), использование С_15:1,, С_17:1, C_18:3ω6 как диагностических маркеров нецелесообразно.

Наилучшим молекулярным маркером для диагностики ЦИН 3-й степени матки является локальная величина В7.2 (Se = 0,83; Sp = 0,73; Ac = 0,78; AUC = 0,77) (рис. 1).

Информативность разработанной диагностической модели высока по сравнению с результатами цитологического исследования (рис. 2).

Обсуждение

В ходе исследования изучали информативность использования локальных величин ВЖК, сосудисто-воспалительных факторов, белков контрольных точек иммунного цикла в качестве диагностических маркеров ЦИН 3-й степени.

Среди насыщенных ВЖК диагностическим потенциалом обладали С_14:0, С_15:0, С_16:0, С_17:0, С_20:0, детектируемые на локальном уровне. Полученные результаты отражают атипичный метаболизм ВЖК в процессе цервикального канцерогенеза, необходимый для жизнедеятельности диспластической и опухолевой клетки: гиперэкспрессия синтазы ВЖК, синтез ВЖК с нечетным числом атомов углерода, интенсификация реакций элонгации, что является ключевым метаболическим звеном для изменения структуры биологической мембраны, ее поляризации, проницаемости, модификации ряда онкогенных белков, регулирующих малигнизацию эпителия [16].

Среди моноеновых ВЖК диагностическое значение имели С_15:1, С_17:1. Интересно, что повышение доли ВЖК с нечетным числом атомов углерода является одной из биохимических особенностей гиперпролиферативных и опухолевых тканей [11].

Среди полиеновых аналогов наилучшим диагностическим значением для выявления ЦИН 3-й степени обладала низкая пороговая величина C_18:3ω6. Патофизиологически это отражает изменение активности  ∆ 6-десатуразы, что было установлено нами ранее [11].

Диагностический потенциал сосудисто-воспалительных факторов для выявления ЦИН 3-й степени установлен только для локальной величины VCAM-1, что указывает на участие VCAM-1 в механизмах воспаления, канцерогенеза через опосредование неоангиогенеза и метастазирования [17].

Среди белков контрольных точек иммунного цикла диагностическим потенциалом для выявления ЦИН 3-й степени обладали локальные величины B7.2, PD-L1, sCD27, PD-L2. При этом наилучшим диагностическим маркером было локальное значение B7.2 ≥ 15 пг/мл. Зарегистрированные особенности подтверждают изменения активности противоопухолевого иммунного цикла, блокирование противоопухолевого иммунного ответа, что способствует выживанию атипичных клеток и формированию рака [13, 18, 19].

На основании ROC-анализа установлено, что наиболее информативным диагностическим маркером для выявления ЦИН 3-й степени служит локальная величина В7.2 (Se = 0,83; Sp = 0,73; Ac = 0,78; AUC = 0,77).

Заключение

Проведенный анализ молекулярных параметров выявил статистические изменения по величинам ВЖК, локальным значениям VCAM-1 и белков контрольных точек иммунного цикла B7.2, PD-L1, sCD27, PD-L2 у женщин с ЦИН 3-й степени.

В качестве диагностического молекулярного маркера ЦИН 3-й степени можно использовать определение пороговой локальной величины В7.2, значение которой ≥ 15 пг/мл (Se = 0,83; Sp = 0,73; Ac = 0,78; AUC = 0,77) в 83,3% случаев указывает на наличие ЦИН 3-й степени.

Информация о конфликте интересов.
Конфликт интересов отсутствует.

Проведение исследования одобрено локальным этическим комитетом Читинской государственной медицинской академии (протокол № 44 заседания от 9 ноября 2012 г.). Информированное согласие пациента на участие в исследовании получено.

Финансирование.
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта президента Российской Федерации для государственной поддержки молодых российских ученых МК-6143.2018.7 (соглашение № 075-02-2018-547).