Полиморфный вариант С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости МDR1 у больных с трансплантированной почкой

Таблица 1. Характеристика молекулярно-генетического маркера, использованного в и цитостатики, антивирусные препа- сследовании

Таблица 2. Частота генотипов полиморфного локуса С3435Т гена MDR1 у реципиентов почечного трансплантата и в группе контроля

Рисунок. Частота развития хронической трансплантационной нефропатии у реципиентов с различным генотипом гена MDR1

Введение

В настоящее время во всем мире наблюдается увеличение в общей численности населения доли лиц пожилого возраста. В этой связи возрастает частота хронической болезни почек (ХБП), которая развивается при таких распространенных среди пожилых людей заболеваниях, как инсулиннезависимый диабет, артериальная гипертензия, кардиальная патология, а также характерной для этого возраста полипрагмазии [1–3].

Продление жизни пациентам с пятой стадией ХБП, улучшение качества их жизни возможно только методами заместительной почечной терапии [4]. Трансплантация почки бесспорно считается наиболее эффективным способом лечения больных с терминальной уремией, но доступность этого вида заместительной почечной терапии ограничена дефицитом трупных донорских органов [5]. Ежегодно в России выполняется 1300–1350 трансплантаций органов, в том числе около 1000 трансплантаций почки, а количество больных с функционирующим трансплантатом на конец 2011 г. составило 5932 (41,5 человек на 1 млн населения) [6]. Пятилетняя выживаемость почечного трансплантата, по данным отчета Российского регистра заместительной почечной терапии за 1998–2011 гг., составляет 82,3% при пересадке трупной почки и 91,5% от живого родственного донора [7]. Основная причина гибели трансплантированной почки в отдаленные сроки после операции – отторжение трансплантата, что проявляется постепенно прогрессирующим снижением его функции.

Полноценное функционирование почечного трансплантата после аллотрансплантации почки обеспечивается правильно подобранной многокомпонентной иммуносупрессивной терапией [8]. Циклоспорин А – основной лекарственный препарат, который используется для профилактики и лечения реакции отторжения трансплантата. Однако вопрос об оптимальных режимах дозирования этого препарата до сих пор остается предметом дискуссии, поскольку недостаточная доза циклоспорина А повышает риск отторжения, а передозировка ведет к развитию циклоспориновой нефротоксичности  [9–11].

В последние годы изучается влияние полиморфных вариантов генов на фармакокинетику лекарственных средств. Особый интерес в этом отношении представляет ген множественной лекарственной устойчивости МDR1 (multidrug resistance), локализованный на хромосоме 7 (7q21.1). МDR1 кодирует Р-гликопротеин, который выполняет разнообразные функции. В желудочно-кишечном тракте Р-гликопротеин играет роль своеобразного насоса, «выкачивающего» лекарственные средства из клетки в просвет кишечника. В гепатоцитах он способствует выведению ксенобиотиков в желчь. В почечных канальцах участвует в активной секреции ксенобиотиков в мочу [12]. Субстратами Р-гликопротеина являются многие широко применяемые лекарственные препараты: циклоспорин А [13, 14], такролимус [15], блокаторы Н1-гистаминовых рецепторов [16, 17], цитостатики, антивирусные препараты, антагонисты кальция, статины, макролиды и др. [12].

Мутации в некоторых сайтах гена МDR1 могут приводить к изменению профиля перекрестной устойчивости клеток, то есть к изменениям в связывании определенных субстратов [18]. Полиморфный вариант С3435Т в 26-м экзоне гена МDR1 в гомозиготном состоянии приводит к резкому снижению экспрессии и функциональной активности Р-гликопротеина и, как следствие, к увеличению уровня субстрата в плазме.

Для индивидуализации иммуносупрессивной терапии наиболее перспективными являются молекулярно-генетические методы, в частности исследование полиморфных локусов гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 [12, 19, 20, 21]. В трансплантологии исследование полиморфных вариантов гена множественной лекарственной устойчивости MDR1 проведено у больных с пересадкой сердца [13, 22]. Однако в нефротрансплантологии подобные исследования единичны и носят противоречивый характер. По мнению ряда авторов, у больных, подвергшихся трансплантации почки, генотип ТТ полиморфного локуса С3435Т гена МDR1 ассоциирован с более высокими уровнями такролимуса в плазме крови [15].

Материал и методы

С целью оценки некоторых молекулярно-генетических факторов риска развития хронической трансплантационной нефропатии у 61 взрослого пациента после аллотрансплантации почки проведен углубленный молекулярно-генетический анализ полиморфного варианта С3435Т гена MDR1. Материалом для молекулярно-генетического исследования послужили образцы ДНК, выделенные из лимфоцитов периферической венозной крови методом фенольно-хлороформной экстракции [23]. Анализ полиморфного локуса гена MDR1 проводили методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК на термоциклере в автоматическом режиме с использованием локусспецифических олигонуклеотидных праймеров и соответствующих рестриктаз [24] (табл. 1).

Группу сравнения составили 100 практически здоровых добровольцев, сопоставимых по полу, возрасту и национальности с основной группой.

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью биометрических методов анализа [25]. Достоверность различий определяли с помощью t-критерия Стьюдента. Частоту генотипов (Рi) и аллелей (pi) определяли стандартным способом, как P = N_i / N, где N_i – число i-тых генотипов (аллелей), N – объем выборки (число проанализированных хромосом). Разницу в распределении частот генотипов между группами рассчитывали с использованием критерия χ² с поправкой Йетса на непрерывность с помощью программы RxC-статистика (Rows and Columns) и Statistica 6,0. Для оценки относительного риска заболевания по конкретному аллелю или генотипу использовали вычисление показателя отношения шансов [26], проводился расчет доверительного интервала для отношения шансов.

Результаты и их обсуждение

Возраст реципиентов почечного трансплантата колебался от 18 до 56 лет (в среднем 34,7 ± 1,44 года). Доля больных в возрасте от 21 до 25 лет составила 18,6%. Причиной терминальной уремии более чем у половины (65,6%) пациентов был хронический гломерулонефрит. Аллотрансплантация почки была произведена 47 пациентам, 14 пациентам пересажена родственная почка. Большинству (n = 59, 96,7%) пациентов проведена одна аллотрансплантация почки, одному пациенту – две и одному – три. Диагноз хронической нефропатии трансплантата в соответствии с общепринятой классификацией Banff 97 подтверждался клиническими, лабораторными и инструментальными данными, а также гистологическим исследованием биоптата почечного трансплантата.

При сравнении распределения частот различных генотипов полиморфного локуса С3435Т гена МDR1 выявлено, что генотип ТТ в группе реципиентов почечного трансплантата определялся в 1,5 раза реже (30,26%), чем в группе контроля (47,33%) (р = 0,029). Распределение гетерозиготного генотипа СТ в обеих сравниваемых группах оказалось практически одинаковым (48,21 и 46,56%). Генотип СС у пациентов после аллотрансплантации почки встречался в 3,5 раза чаще (21,43 против 6,11% в группе контроля) (р = 0,0038) (табл. 2).

По нозологиям реципиенты почечного трансплантата с различными генотипами практически не отличались, но сроки развития пятой стадии ХБП у пациентов с генотипом СС оказались статистически значимо короче, чем у больных с генотипом СТ (р < 0,05). Достоверных различий в данных лабораторных и инструментальных исследований у реципиентов с различными генотипами гена MDR1 не обнаружено.

Проведено сравнение доз циклоспорина А, необходимых для достижения средней терапевтической концентрации в крови (С3  –  400 нг/мл, С0 – 100 нг/мл) при различных генотипах по полиморфному локусу С3435Т гена MDR1. Установлено, что через один год после трансплантации почки для достижения рекомендуемой концентрации циклоспорина А в крови доза препарата у реципиентов с генотипом ТТ составила в среднем 210,6 ± 14,56 мг. Значимо меньше была доза препарата у пациентов с генотипом СС – 170,0 ± 12,94 мг (р < 0,05) в сравнении с реципиентами, имеющими генотип ТТ. При генотипе СТ доза циклоспорина А имела промежуточное значение – 181,5 ± 9,07 мг (табл. 3).

В то же время при анализе доз циклоспорина А для достижения необходимой концентрации в сыворотке крови обнаружено, что у пациентов с генотипом СС доза препарата была наиболее низкой, а хроническая трансплантационная нефропатия встречалась реже по сравнению с реципиентами, имеющими генотип СТ или ТТ. Однако дозы препарата циклоспорина А у реципиентов с генотипом СС были достаточными для предотвращения отторжения трансплантата.

Полученные данные можно объяснить тем, что генотип СС характеризуется повышенной выработкой белка-переносчика Р-гликопротеина и ускоренным выведением из клетки экотоксикантов, к которым относятся и лекарственные препараты, в том числе циклоспорин А. Для генотипа ТТ свойственна пониженная выработка Р-гликопротеина. Это может обусловливать накопление препарата в тканях и внутри клеток, вследствие чего концентрация препарата в крови снижается, что ведет к необходимости повышения дозы циклоспорина и увеличению риска развития хронической трансплантационной нефропатии при сравнении с генотипами СТ и СС (χ² = 1,93, р = 0,059).

Хроническая трансплантационная нефропатия диагностирована при всех генотипах полиморфного локуса С3435Т гена MDR1. Наиболее часто хроническая трансплантационная нефропатия развивалась у пациентов с генотипом ТТ – в 58,33% случаев, при генотипе СС – в 41,67% и генотипе СТ – в 51,86% случаев (χ² = 0,086, р = 0,66) (рисунок).

У пациентов с генотипом СС, то есть с нормальным уровнем Р-гликопротеина и ускоренным выведением препарата из клетки в кровь, доза циклоспорина А для достижения терапевтической концентрации была самой низкой. Риск развития хронической трансплантационной нефропатии у таких пациентов уменьшался. Реципиентам с генотипом ТТ для достижения рекомендованной концентрации препарата в крови требовались более высокие дозы циклоспорина А, у них чаще развивалась хроническая трансплантационная нефропатия.

Таким образом, исследования генетических особенностей человека, в частности полиморфных вариантов гена MDR1, представляют практический интерес для клиницистов. Изучение полиморфных вариантов гена MDR1 у реципиентов почечного трансплантата позволяет корригировать дозу циклоспорина А и уменьшить риск развития хронической трансплантационной нефропатии.

Выводы

Среди реципиентов почечного трансплантата по сравнению со здоровыми лицами статистически реже встречались пациенты с генотипом ТТ полиморфного локуса С3435Т гена множественной лекарственной устойчивости MDR1.

Хроническая нефропатия трансплантата чаще развивалась у пациентов с генотипом ТТ полиморфного локуса С3435Т гена MDR1 в сравнении с пациентами, имеющими генотип СС и СТ.

Доза циклоспорина А, назначаемая для достижения адекватной иммуносупрессивной терапии под контролем рекомендуемой концентрации препарата в крови, при генотипе ТТ была выше, чем при генотипе СС.