Проблемы неинвазивной визуализации бета-клеток поджелудочной железы

Рисунок. Визуализация островков поджелудочной железы в группе контроля (А) и группе больных с дебютом СД 1 типа (Б) [22]

Сахарный диабет (СД) 1 типа является аутоиммунным заболеванием, для которого характерна лимфоцитарная инфильтрация островков Лангерганса поджелудочной железы с постепенным уменьшением количества функционирующих бета-клеток, приводящим к абсолютному дефициту инсулина. Лучшее понимание патогенеза СД возможно при контроле динамики состояния бета-клеток в течение болезни и на фоне терапии. Появление неинвазивных методов диагностики, которые позволяют визуализировать начало заболевания, его прогрессирование в период скрытой фазы, во многом способствовало бы как дальнейшему развитию фундаментальных клинических исследований, так и разработке методов терапии диабета, направленных на предотвращение деструкции островковых клеток.

Применение методов магнитного резонанса, биолюминесценции, позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) или однофотонной эмиссионной компьютерной томографии (ОФЭКТ), возможно, позволит визуализировать островковые клетки, выявить их распределение, жизнеспособность и функциональную активность.

Сцинтиграфия – метод визуализации, основанный на специфическом накоплении и последующем обнаружении гамма-излучения в результате распада введенного в организм радиоактивного изотопа. ПЭТ и ОФЭКТ позволяют получить более или менее точные изображения распределения препарата, а также количественную оценку его концентрации и информацию о фармакокинетике маркера.

M.D. Normandin и соавт., исследовав группу больных СД с различной длительностью заболевания, показали, что использование радиоактивного индикатора 18F-FP-(1)-DTBZ, известного как 18F-AV-133, при проведении ПЭТ позволяет достаточно точно измерить клинически значимые изменения массы бета-клеток в поджелудочной железе [1]. Концентрация радиоактивного препарата была на 37,7% ниже в поджелудочной железе больных СД 1 типа, чем в контрольной группе, но не отличалась от концентрации в почках. Общее поглощение радиофармпрепарата в единице объема поджелудочной железы было также снижено на 19,8% у пациенов с СД 1 типа (по сравнению с контрольной группой). Относительное поглощение радиоизотопа в почках по отношению к плазме было слегка повышено у пациентов с СД 1 типа по сравнению с контрольной группой, но существенно не различалось между группами. Таким образом, путем количественной визуализации – с помощью 18F-FP-(1)-DTBZ ПЭТ – было подтверждено, что у пациентов с длительным анамнезом СД 1 типа заметно снижается накопление 18F-FP-(1)-DTBZ в поджелудочной железе по сравнению со здоровыми лицами. Эти исследования показали, что ПЭТ с 18F-FP-(1)-DTBZ может быть использована как для количественной оценки массы бета-клеток, так и для оценки функциональной клеточной активности [1].

R. McGirr и соавт. на животных моделях показали, что с помощью ПЭТ можно обнаружить изменения в бета-клеточной массе, которые предшествуют диабету [2].

Учитывая, что рецептор глюкагоноподобного пептида 1 (glucagon-like peptide-1 – GLP-1R) играет важную роль в синтезе инсулина бета-клетками поджелудочной железы, S.T. Lo и соавт. на животных моделях с СД 1 типа, индуцированным стрептозотоцином, применили ПЭТ как неинвазивный метод мониторинга массы бета-клеток, используя рецептор GLP-1R как мишень радиофармпрепарата (68Ga-НОТА-EM2198). Результаты проведенной работы показали значительное снижение поглощения изотопа поджелудочной железой животных с СД. Гистологические исследования продемонстрировали корреляцию между уровнем поглощения радиофармпрепарата и количеством бета-клеток островков. Таким образом было показано, что применение радиоизотопа (68Ga), тропного к рецепторам GLP-1, имеет большой потенциал для неинвазивной оценки изменения бета-клеточной массы с помощью ПЭТ [3].

Приняв во внимание результаты последних исследований, подтвердивших экспрессию везикулярных (синаптических) транспортеров моноаминов 2-го типа (vesicular monoamine transporter – VMAT) в островках поджелудочной железы, M.P. Kung и соавт. на животных моделях смогли показать высокую специфичность VMAT 2, меченного производным дегидротетрабеназина (ДТБН), при проведении ПЭТ. Это может быть использовано для количественной оценки массы бета-клеток и стать еще одним шагом к пониманию связи между потерей инсулин-секретирующих бета-клеток и началом СД [4].

Однако ПЭТ и ОФЭКТ имеют ограниченное пространственное разрешение (для ПЭТ от 3 мм), что не позволяет с помощью сцинтиграфии визуализировать отдельные островки поджелудочной железы, а определение массы бета-клеток требует высокого накопления маркера, который специфично связывается с бета-клетками.

Еще одной проблемой на пути к успешному применению этого метода является отсутствие идеального маркера. В некоторых работах с целью определения массы бета-клеток предлагалось в качестве мишени использовать допаминовый рецептор D2 [5] и визуализировать его с помощью 18F-ДОФА ПЭТ. Однако из-за высокого накопления меченой молекулы в экзокринной части органа попытки использовать меченые молекулы провалились. Как альтернатива проводилось тестирование возможности использования радиомаркированного дегидротетрабеназина VMAT 2. У людей VMAT 2 присутствует в бета-клетках [6, 7], в симпатических нервах в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и поджелудочной железе [8]. Несмотря на специфичность связывания с VMAT 2 в условиях in vitro, в экзокринной части поджелудочной железы наблюдалось высокое и неспецифическое накопление маркированного ДТБЗ [9, 10]. В идеальной ситуации накопление маркера другими эндокринными клетками островка должно быть минимальным. Указанные биологические ограничения, а также низкое пространственное разрешение и артефакты, присущие ПЭТ, делают сомнительным реальное использование данного метода для точной количественной оценки массы бета-клеток у пациентов.

Кроме того, для визуализации массы бета-клеток рассматривалось использование рецепторов к сульфонилмочевине (SUR1) [11, 12]. Однако экспрессия этих рецепторов всеми типами островковых клеток повлияла на точность результатов и ограничила их применение [13, 14]. Радиофармпрепараты с высокой специфичностью должны привести к высокому коэффициенту соотношения бета-клетки/среда. Однако, даже когда радиофармпрепарат обладает высокой специфичностью, это автоматически не приводит к успешной визуализации мишени на сцинтиграфических сканерах. Например, когда клиренс препарата из крови низок, неспецифический сигнал от маркера, циркулирующего в сосудистом русле, может затруднять определение и количественный расчет специфического сигнала от бета-клеток. Таким образом, требуется как высокий уровень поглощения радиофармпрепарата эндокринной частью поджелудочной железы по сравнению с экзокринной, так и высокий уровень поглощения препарата поджелудочной железой по сравнению с окружающими органами и кровью. Например, в исследованиях с участием животных моноклональные поверхностные антитела островковых клеток IC2 специфически направлялись к бета-клеткам, и поглощение меченных ¹²⁵IIC2 линейно коррелировало с массой бета-клеток [15]. Однако из-за низкого клиренса данного моноклонального антитела из крови, большого размера молекулы его применение у людей ограничено.

F(ab)-2-фрагменты, отдельные цепи антител, наночастицы и белки-миметики антител могут быть интересной альтернативой, если они обладают специфичностью и аффинностью к мишеням, которые соответствуют мишеням естественных антител, но у них более быстрый клиренс из-за значительно меньшего размера.

Пути выделения также влияют на соотношение мишень/среда. Гидрофильные молекулы, как правило, выделяются через почки, тогда как гидрофобные и крупные молекулы – посредством гепатобилиарной системы. Почечный клиренс может вызвать неспецифическую канальцевую абсорбцию радиомаркированных пептидов, а анатомическая близость к поджелудочной железе – нарушить визуализацию бета-клеток [16]. Клиренс при помощи гепатобилиарной системы приводит к высокому накоплению маркера в печени и, как следствие, к экскреции маркера в органы пищеварения и увеличению концентрации радиоактивного вещества в ЖКТ. В свою очередь высокое накопление радиофармпрепарата в ЖКТ снижает соотношение поджелудочная железа/среда. Это является аргументом в пользу ¹¹C- и ¹⁸F-меченного ДТБЗ, который остается объектом исследований. Использование эпоксидного производного изменяет путь выведения маркера на почечный, благодаря чему снижается накопление препарата в других органах [17].

Другим важным аспектом идеального маркера для визуализации бета-клеток является их удельная активность, то есть количество радиоактивного излучения (как правило, выраженное в Бк) на введенное количество маркера (обычно выраженного в молях). Высокие дозы, требующиеся для визуализации островков малого размера, могут временно блокировать мишень и снижать накопление маркера [18]. Более того, маркеры, которые требуют введения в больших дозах, могут вызвать побочные эффекты, особенно при использовании биологически активных веществ или их производных (например, аналогов глюкагоноподобного пептида 1 (ГПП-1) или агонистов SUR1).

Стабильность маркера также играет важную роль в успешной диагностике, так как химически нестабильные молекулы мало или вообще не накапливаются в клетках-мишенях. Например, ¹²⁵I-меченный дитизон, хелатор тяжелых металлов, который окрашивает бета-клетки в условия in vivo по причине высокого содержания в них цинка, быстро расщепляется, высвобождая ¹²⁵I в биологические жидкости. Одновременное введение гистамина увеличивает стабильность радиойодированного дитизона, но эта модификация увеличивает его накопление в печени и экзокринной части поджелудочной железы, что делает этот подход бесполезным для визуализации бета-клеток. Большинство пептидов подвергаются деградации эндогенными пептидазами, что снижает их аффинность к рецепторам и/или биологическую активность. Предотвращение деградации пептида может быть достигнуто благодаря связыванию его с крупными белками, например альбумином. Так, ГПП-1, конъюгированный с альбумином, удлиняет сигнал от рецептора ГПП-1. Однако это приводит к снижению клиренса из-за крупного размера комплекса и снижает коэффициент соотношения поджелудочная железа/среда [19].

Еще одним перспективным методом визуализации бета-клеток поджелудочной железы является магнитно-резонансная томография (МРТ). Она проводится для получения высококачественных изображений органов. МРТ основана на принципах ядерного магнитного резонанса, а также методе спектроскопии, который используется для получения данных о химических и физических свойствах молекул [20].

МРТ имеет несколько преимуществ перед сцинтиграфией: более простое применение, отсутствие необходимости в использовании радиоактивных изотопов и возможность многократного проведения. МРТ обладает высоким пространственным разрешением, позволяющим визуализировать даже отдельные островки. Это было показано в исследовании с участием животных, где использовался томограф с напряженностью поля более 14 Тл [21].

L. Jason и соавт. предложили использовать МРТ с магнитными наночастицами (МНЧ) – ферумокстраном-10 с целью повысить визуализацию поджелудочной железы у пациентов с СД 1 типа в дебюте [22]. Выбор данного метода был обусловлен его эффективностью, продемонстрированной в многочисленных исследованиях на животных моделях с СД 1 типа. Проводилось исследование и у пациентов с инсулитом. При этом использовались фаготропные наночастицы, длительно циркулирующие в крови, проникающие через стенку сосуда в окружающие ткани и поглощаемые макрофагами. Измерение накопления наночастиц с помощью МРТ позволяет оценить основные маркеры и факторы прогрессирования заболевания. Хотя в этом исследовании основное внимание уделялось определению состояния сосудистой стенки и лейкоцитарной инфильтрации, был измерен также объем поджелудочной железы. Это имеет значение у пациентов с СД, учитывая атрофию железы как характерную черту длительного СД 1 типа. Об атрофии свидетельствует изменение объема поджелудочной железы, наблюдаемое при проведении ультразвукового исследования, компьютерной томографии или МРТ, а также аутопсии. С этой целью был рассчитан индекс панкреатического объема (ИПО) – отношение объема поджелудочной железы к площади поверхности тела пациентов. ИПО в группе пациентов, страдающих СД 1 типа, был на 21% ниже, чем в контрольной группе.

С целью индикации сосудистой проницаемости и лейкоцитарной инфильтрации как основного маркера инсулита были использованы данные о локальных изменениях в Т2-режиме.

Обследование пациентов было проведено до и через 48 часов после введения ферумокстрана с зависимым от концентрации снижением интенсивности сигнала, основанным на Т2-взвешенных последовательностях (рисунок). Более низкая Т2 (ярко-красный цвет) внутри поджелудочной железы после 48 часов предполагает более высокое накопление МНЧ у пациентов по сравнению со здоровыми добровольцами. У пациентов на Т2-взвешенных изображениях также наблюдалась большая неоднородность внутри поджелудочной железы со значительными изменениями в Т2 (и потенциально более активным инсулитом) [22].

L. Leoni и соавт. [23] предложили использовать марганец, который давно применялся как контрастный агент для МРТ в диагностике функционирования тканей сердца у животных, изображении мозга и исследовании нейронных путей. Авторы предприняли попытку расширить его использование в исследовании бета-клеток поджелудочной железы и показали, что в присутствии MnCl2 активированные глюкозой островки Лангерганса дают значительное увеличение сигнала на T1-взвешенных МРТ-изображениях. В этих исследованиях была применена рентгеновская флюоресцентная микроскопия для визуализации и подсчета количества металла в бета-клетках на клеточном и субклеточном уровнях. Анализируя результаты, авторы пришли к выводу, что МРТ с применением марганца может быть использована для оценки функциональной активности бета-клеток [23, 24].

К недостаткам МРТ относится прежде всего меньшая чувствительность, чем у сцинтиграфии. Именно поэтому МРТ в настоящее время используется для визуализации предварительно меченных островков, а не нативных островков in situ. Предварительное введение метки позволяет достичь более высоких ее концентраций в соответствующих клетках с более низкой концентрацией в окружающих тканях вследствие низкого уровня неспецифического поглощения.

Чувствительность МРТ зависит от нескольких факторов: особенности оборудования для анализа, однородности образца, количества контрастного вещества, проникшего в клетку, используемых последовательностей импульсов, плотности клеток и в некоторых случаях межклеточного распределения контрастного вещества. Используемая концентрация контрастного вещества может вследствие этого варьироваться, хотя для суперпарамагнитных частиц оксида железа, как правило, требуются наномолярные концентрации [25].

Прямая визуализация немаркированных островков у людей при использовании стандартных клинических подходов пока невозможна из-за ограниченного разрешения (за пределами размера среднего островка) и слабого дифференциального контрастирования островков в сравнении с окружающей тканью поджелудочной железы. Исходя из сказанного, основной принцип – использование непрямых методов для оценки массы бета-клеток и функции островков. Например, функциональная МРТ, оценивающая уровень кислорода, не требует использования экзогенного контрастного вещества и подлежит количественной оценке [26]. До сих пор, однако, успех преклинических испытаний не был воспроизведен в условиях клиники [27]. Поэтому сейчас разрабатываются другие подходы для маркирования островковых клеток in situ перед проведением МРТ.

Сложной задачей остается оценка жизнеспособности и функциональной активности трансплантированных в печень островков поджелудочной железы. K. Andralojc и соавт. выделили ряд препятствий на пути к визуализации пересаженных бета-клеток при применении МРТ [28]. Во-первых, для визуализации изолированных островков необходимо применение предварительной маркировки, которая в ряде случаев затруднена по причине низкой фагоцитарной активности этих клеток. Во-вторых, природа (например, частицы металла) и крупный размер некоторых МРТ-маркеров (например, липосома – более 300 нм в диаметре) могут еще больше затруднить их поглощение и повлиять на функцию и жизнеспособность островковых клеток. В-третьих, применение прямого маркирования с использованием гадолиния или хелатных соединений оксида железа ограниченно по причине токсического воздействия на организм человека. Дальнейшие подходы, используемые для увеличения поглощения маркера, – это инкапсуляция островков в проницаемые капсулы вместе с МРТ-контрастом. Однако состояние островков внутри капсулы, их выживание и функционирование остаются неизвестными.

Препятствием на пути к визуализации трансплантата являются также воспаление, кровотечение или отек, которые могут изменять локальный контраст изображения и давать ложноположительный результат.

Другой проблемой является количественная оценка МРТ-изображений, полученных при помощи контрастных веществ. Накопление контрастных веществ плохо поддается количественному определению, а участки контрастирования на изображениях могут отражать скопления островков, а не отдельные островки [29]. Таким образом, интерпретация данных от пересаженных в печень меченых островков сложна из-за возможных ложноположительных результатов.

В заключение необходимо отметить, что некоторые подходы, уже доступные для фундаментальных исследований на животных моделях, позволяют прямую визуализацию отдельных островков. Это методы, не нуждающиеся в предварительном маркировании [30] или позволяющие провести количественную оценку массы бета-клеток практически полностью неинвазивно [31]. Ни один из этих подходов не является простым в использовании и не обладает свойствами, необходимыми для рутинной визуализации массы бета-клеток. Их использование в клинической практике затруднено из-за многих технологических и связанных с вопросами безопасности факторов, специфических гистологических и анатомических особенностей поджелудочной железы человека. Между тем они могли бы способствовать лучшему пониманию патогенеза СД 1 и 2 типа.