Ангиопротекторный и регенеративный потенциал полипептидного препарата Славинорм при эндотелиальной дисфункции и атеросклеротическом поражении сосудов

Рис. 1. Миграция эндотелиальных клеток человека (HUVEC) в камерах Бойдена (А – контрольная группа без индукторов клеточной гибели и SN (Славинорм); Б – 5 мкг/мл cis-Pt (цисплатин); В – 5 мкг/мл cis-Pt + 50 мкг/мл SN; Г – 5 мкМ H2O2; Д – 5 мкМ H2O2 + 50 мк

Определение миграционной активности эндотелиальных клеток

Рис. 2. Количество клеток с активной каспазой-3 под действием 5 мкг/мл cis-Pt и 5 мкМ H2O2 в комбинации с 50 мкг/мл SN

Рис. 3. Оценка апоптоза и гибели клеток линии HUVEC под действием 5 мкг/мл cis-Pt и 5 мкМ H2O2 в комбинации с 50 мкг/мл SN при помощи Annexin V/PI после 48 часов инкубации

Рис. 4. Оценка распределения клеток линии HUVEC по фазам клеточного цикла под действием 5 мкг/мл cis-Pt и 5 мкМ H2O2 в комбинации с 50 мкг/мл SN при помощи Annexin V/PI после 48 часов инкубации

Рис. 5. Дифференцировка эндотелиальных клеток человека (HUVEC) in vitro

Введение

Атеросклероз представляет собой мультифокальное прогрессирующее заболевание артерий, характеризующееся нарушением обмена липидов, утолщением и потерей эластичности сосудистой стенки. Данная патология является основной причиной развития сердечно-сосудистых заболеваний и одной из основных причин смертности и инвалидизации населения [1].

Главным пусковым механизмом развития атеросклероза считается развитие эндотелиальной дисфункции – системной патологии, связанной с нарушением структуры и секреторной функции эндотелия – монослойной внутренней выстилки кровеносных сосудов. Эндотелий секретирует химические факторы, влияющие на сосудистый тонус, проницаемость сосудистой стенки, агрегацию тромбоцитов, процессы воспаления, активации и угнетения роста сосудов: оксид азота, простациклины (простагландин I2), эндотелиальный гиперполяризующий фактор, эндотелин I, ангиотензин II, тромбоксан [2, 3]. Повреждение эндотелия приводит к дисбалансу между вазоконстрикцией и вазодилатацией, увеличению проницаемости эндотелия, агрегации тромбоцитов, адгезии лейкоцитов и высвобождению цитокинов, что влечет за собой развитие и прогрессирование сосудистой патологии.

Факторами риска развития эндотелиальной дисфункции служат не только биологический возраст человека и его наследственность, но и образ жизни: курение, психо­эмоциональный стресс, малоподвижный образ жизни, несбалансированное питание, нарушение режима сна и бодрствования и, как следствие, дислипидемия (гиперхолестеринемия), метаболический синдром, ожирение, сахарный диабет, артериальная гипертензия и др. [4, 5]. Указанные факторы приводят к многочисленным биохимическим и метаболическим изменениям, способствующим повреждению эндотелия сосудов, снижению выживаемости клеток и замедлению регенеративных процессов.

Большие усилия исследователей направлены на поиск средств, влияющих непосредственно на состояние эндотелия [6]. В последнее время особый интерес вызывают препараты на основе регуляторных пептидов, оказывающие патогенетическое действие при эндотелиальной дисфункции. Пептиды образуются из белков во всех тканях и являются одной из самых эволюционно ранних систем регуляции гомеостаза.

Препарат Славинорм, в состав которого входят полипептиды сосудов крупного рогатого скота, запускает каскад метаболических реакций, приводящих к снижению перекисного окисления липидов и нормализации эндотелиальной функции, и потенциально препятствует развитию атеросклероза [7].

Клиническая эффективность препарата Славинорм подтверждена в клинических исследованиях с участием пациентов с облитерирующими заболеваниями артерий нижних конечностей. На фоне терапии отмечалось значимое увеличение дистанции безболевой ходьбы, максимально проходимого расстояния и лодыжечно-плечевого индекса [8].

В настоящем исследовании использовались различные методики оценки функциональности эндотелиальных клеток человека и мыши in vitro на фоне применения препарата Славинорм – способности к миграции и инвазии при формировании новых микрососудов, протективного действия на эндотелиальные клетки при индукции апоптоза и гибели клеток, оценка влияния Славинорма на клеточный цикл. Для повышения значимости полученных результатов в экспериментах использовались различные культуры эндотелиальных клеток человека и мыши.

Материал и методы

Материал

Исследование было выполнено на клеточных линиях:

• эндотелиальные клетки мыши SVEC-4-10 (ATCC, США);
• эндотелиальные клетки человека HUVEC (Lonza, Швейцария), EA.hy926 (ATCC, США).

Для культивирования клеток использовали:

• среду культуральную DMEM (Gibco, США);
• среду культуральную для эндотелиальных клеток EGM-2 (Lonza, Швейцария) с добавлением L-глутамина (Capricorn Scientific, США);
• ЭТС (HyClone, США), PenStrep (Lonza, Швейцария);
• рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов человека – VEGF (Invitrogen, США);
• рекомбинантный фактор роста эндотелия сосудов мыши – VEGF (Invitrogen, США);
• рекомбинантный фактор роста фибробластов человека – FGF (Invitrogen, США).

Препарат Славинорм (ООО «Самсон-Мед», Россия) был предоставлен ООО «ПептидПро» (Москва, Россия). В работе также использовались МТТ (3-[4,5-диметилтиазол-2]-2,5-дифенилтетразол бромид (Sigma-Aldrich, США)), формалин (БиоВитрум, Россия), кристаллический фиолетовый краситель (Хеликон, Россия), аннексин V-FITC (Invitrogen, США), йодид пропидия (Invitrogen, США), антитела к активной каспазе-3 (Invitrogen, США).

Исследование влияния препарата Славинорм на миграционный потенциал эндотелиоцитов в камерах Бойдена

Данный метод применяли для оценки потенциала препарата в индуцировании миграции эндотелиальных клеток для формирования новых микрососудов взамен поврежденных.

Клетки высеивали на поверхность полупроницаемой мембраны камеры Бойдена с порами размером 8 мкм, покрытую полимеризованным матриксом Матригель (1,0 мг/мл) для имитации условий естественного микроокружения, которые допускают миграцию клеток только к аттрактанту, размещенному в нижней камере.

Растворы исследуемого лекарственного средства вносили в камеры Бойдена к суспензии эндотелиальных клеток человека и мыши. В нижнюю камеру вносили 700 мкл среды DMEM с ЭТС 20%. В качестве положительного контроля использовали клетки в культуральной среде без добавления исследуемого лекарственного средства. По истечении 24 часов инкубации клетки фиксировали в формалине 4%, проводили пермеабилизацию клеток 0,1% Tween 20 в PBS и окрашивали кристаллическим фиолетовым красителем. Результаты ингибирования инвазивного потенциала оценивали как отношение количества клеток в опытных группах к количеству клеток группы интактного контроля.

Исследование миграционной активности эндотелиальных клеток

Определение блокирования миграционной активности проводили на культурах эндотелиальных клеток человека и мыши в 24-луночных культуральных планшетах. С помощью наконечника удаляли монослой клеток прямо­угольной формы в центре каждой лунки, чтобы обеспечить пространство для миграции клеток и повторного формирования монослоя. Исследуемое вещество разводили в полной среде (со стандартным содержанием сыворотки) до исследуемых концентраций и вносили в лунки планшета. В качестве положительного контроля использовали клетки в полной культуральной среде. По окончании инкубации планшеты промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) дважды и фиксировали формалином 4%. После фиксации клеток монослой дважды отмывали в PBS и окрашивали с помощью кристаллического фиолетового красителя.

После окраски монослой клеток дважды отмывали в PBS и делали серию микрофотографий области «раны» на инвертированном микроскопе с фотокамерой. Результаты ингибирования миграционной активности оценивали как процент прироста мигрирующих клеток в опыте по отношению к проценту прироста клеток.

Определение уровня активной каспазы-3 методом проточной цитометрии

Гибель эндотелиоцитов на фоне нарушения транспорта кислорода преимущественно происходит по механизму апоптоза (реже – некроза) и приводит к дисфункции эндотелия [9]. Активация каспазы-3 является основным этапом и индикатором индукции клеточного апоптоза. Протеолитический фермент определяли окрашиванием эндотелиальных клеток человека и мыши флуоресцентным конъюгатом антител к активной каспазе-3. К клеточной суспензии однократно добавляли цисплатин (индуктор повреждения клеточной ДНК), H2O2 (индуктор клеточного окислительного повреждения) и препарат Славинорм, а также их комбинации. Клетки инкубировали при 37 °C в течение 24 часов.

Клетки переносили из культурального планшета в пробирки для проточной цитометрии, пермеабилизировали клетки с помощью 0,1% Tween 20 в PBS, отмывали и добавляли в каждую пробирку по 5 мкл флуоресцентного конъюгата антител к активной каспазе-3 с фикоэритрином или соответствующие изотипические антитела, инкубировали на льду в течение 30 минут. Клетки промывали буфером FACS (PBS, 0,2% BSA, 10 мМ азида натрия) и оценивали количество клеток с экспрессией активной каспазы-3.

Определение уровня апоптоза, гибели и влияния на клеточный цикл эндотелиальных клеток

Клеточные линии SVEC-4-10, HUVEC и EA.hy926 (эндотелиальные клетки мыши и человека) высаживали по 2 × 10⁵ на шестилуночные планшеты в полной среде. Через 24 часа для оценки протективных свойств исследуемого препарата в культуру клеток добавляли 5 мкM H₂O₂ либо 3 мкг/мл цисплатина (cis-Pt) или в комбинации с 50  мкг/мл Славинорма и инкубировали в течение 24 часов.

Для оценки индукции клеток на ранний и поздний апоптоз использовали коммерческий набор Annexin-V FITC Apoptosis Kit. После инкубации клеток с препаратами их центрифугировали, осадок ресуспендировали в 100 мкл PBS, добавляли раствор, содержащий пропидия йодид и аннексин V. Клетки инкубировали при комнатной температуре в темноте в течение 15 минут, затем добавляли 350–400 мкл связывающего буфера для остановки реакции. Анализ данных (не менее 10 000 событий) проводили на проточном цитофлуориметре ACEA NovoCyte с использованием программного обеспечения NovoExpress.

Для анализа клеточного цикла после инкубации с препаратами клетки промывали и снимали с планшетов раствором Версена. Осадок клеток ресуспендировали в 400 мкл буфера, содержащего 50 мкг/мл пропидия йодида, инкубировали в темноте при комнатной температуре в течение 15 минут. Флуоресценцию пропидия йодида измеряли на проточном цитометре ACEA NovoCyte, а распределение клеток по G0 (фаза покоя), G1 (фаза начального роста), S (фаза удвоения молекул ДНК), G2 (премитотическая фаза роста), M-фазам (непосредственно митоз) клеточного цикла анализировали путем определения относительного содержания ДНК.

Изучение влияния препарата на способность эндотелиальных клеток формировать сосудоподобные структуры в 3D-культуре

Анализ формирования сосудоподобных структур (СПС) является одним из наиболее широко используемых анализов in vitro для моделирования стадии реорганизации ангиогенеза и тестирования новых препаратов с потенциальной ангиогенной активностью.

Для проведения исследования 24-луночный культуральный планшет покрывали матриксом Матригель (8,7 мг/мл) и инкубировали в течение часа при комнатной температуре для его полимеризации. Эндотелиальные клетки (5 × 10⁵ клеток/мл) человека и мыши инкубировали в культуральной среде с добавлением нецитотоксических концентраций испытуемых соединений или их комбинации в течение 30 минут при температуре 37 ºС. Затем клетки наносили на лунки, покрытые матриксом Матригель, и инкубировали в СО2-инкубаторе в течение восьми часов. В качестве положительного контроля использовали клетки, инкубируемые в культуральной среде без добавления испытуемого объекта с VEGF/FGF.

По окончании инкубации делали серию фотоснимков образовавшейся сети СПС цифровой фотокамерой и оценивали количество замкнутых сегментов СПС, длину СПС из эндотелиальных клеток в составе замкнутой сети с помощью программы ImageJ v.1.51.

Результаты

Исследование влияния препарата Славинорм на миграционный потенциал эндотелиоцитов в камерах Бойдена

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение количества клеток, прошедших через мембрану, – 26,9% от контрольной группы (р < 0,01) (рис. 1). Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило поддержать количество клеток на уровне 47,7% (p < 0,01) от уровня интактной группы. Аналогичные изменения происходили и при сокультивировании HUVEC c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение количества клеток, прошедших через мембрану под действием 5 мкМ H₂O₂ (24,2% от контроля; р < 0,01), и восстановление количества эндотелиальных клеток при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (41,3% от контроля; р < 0,01).

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека линии EA.hy926 c 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение количества клеток, прошедших через мембрану, в поле зрения по сравнению с количеством клеток в контрольной группе – 24,1% (р < 0,01). Сокультивирование эндотелиальных клеток человека EA.hy926 c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило частично восстановить количество клеток, прошедших через мембрану (41,1% от контроля; p < 0,01). Аналогичные изменения наблюдались и при сокультивировании EA.hy926 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение количества эндотелиальных клеток, прошедших через мембрану под действием 5 мкМ H2O2 (23,8% от контроля; р < 0,01), и восстановление их количества при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (38,6% от контроля; р < 0,01).

Культивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 в присутствии 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение количества клеток, прошедших через мембрану, в поле зрения по сравнению с количеством клеток в контрольной группе – 21,9% (р < 0,01). Сокультивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило поддержать количество клеток, прошедших через мембрану, на уровне 53,7% (p < 0,01) от интактной группы. Аналогичные изменения отмечались и при сокультивировании SVEC-4-10 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение количества клеток, прошедших через мембрану, под действием 5 мкМ H₂O₂ (20,3% от контроля; р < 0,01) и восстановление их количества при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (45,0% от контроля; р < 0,01).

Таким образом, Славинорм увеличивает активность эндотелиоцитов в формировании новых сосудистых структур, о чем свидетельствует увеличение количества клеток, мигрирующих через мембрану в камере Бойдена даже в присутствии цитотоксических факторов.

Исследование миграционной активности эндотелиальных клеток

Анализ методом «заживления раны» позволяет измерить миграцию эндотелиоцитов при удалении монослоя клеток. Созданная область «раны» стимулирует различные клеточные реакции, в основном коллективную миграцию клеток. Данный метод имитирует процесс повреждения и регенерации эндотелия, позволяя оценить выраженность миграции эндотелиальных клеток в зону повреждения.

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение миграционной активности клеток по сравнению с контрольной группой – 48,9% (р < 0,01) (таблица). Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило увеличить миграционную активность клеток (74,8% от контроля; p < 0,01). Аналогичные изменения отмечались и при сокультивировании HUVEC c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение миграционной активности клеток под действием 5 мкМ H₂O₂ (25,4% от контроля; р < 0,01) и восстановление количества эндотелиальных клеток при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (70,4% от контроля; р < 0,01).

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека линии EA.hy926 c 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение миграционной активности клеток по сравнению с контрольной группой – 61,1% (р < 0,01). Сокультивирование эндотелиальных клеток человека EA.hy926 c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило увеличить миграционную активность клеток (82,3%; p < 0,01). Аналогичные изменения наблюдались и при сокультивировании EA.hy926 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение миграционной активности клеток под действием 5 мкМ H₂O₂ (28,7%; р < 0,01) и восстановление при их сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (83,4%; р < 0,01).

Культивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 в присутствии 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение миграционной активности клеток по сравнению с контрольной группой – 21,8% (р < 0,01). Сокультивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма восстанавливает миграционную активность клеток (47,9%; p < 0,01). При сокультивировании SVEC-4-10 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма имело место снижение миграционной активности клеток под действием 5 мкМ H₂O₂ (26,7%; р < 0,01), при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – увеличение (49,9%; р < 0,01).

Определение уровня активной каспазы-3 методом проточной цитометрии

Препарат Славинорм уменьшал количество проапоптотической активной каспазы-3 эндотелиальных клеток человека (HUVEC, EA.hy926) и мыши (SVEC-4-10) в присутствии индукторов повреждения 5 мкг/мл цис­платина и 5 мкМ H₂O₂. Для клеточной линии HUVEC Славинорм снизил количество клеток cCasp3+ с 4,41 до 1,27% при использовании цисплатина и с 3,80 до 1,05% на фоне применения H₂O₂ (рис. 2). Сходные изменения были установлены для клеточной линии EA.hy926: количество клеток cCasp3+ снизилось с 7,90 до 1,85% на фоне применения цисплатина и с 8,31 до 1,88% при использовании H₂O₂. Для клеточной линии SVEC-4-10 Славинорм снизил количество клеток cCasp3+ с 15,17 до 6,26% при применении цисплатина и с 32,93 до 15,07% при использовании H₂O₂. Таким образом, Славинорм показал антиапоптотический эффект, что свидетельствует о протективном действии препарата на клетки эндотелия в условиях патологии.

Определение уровня апоптоза, гибели и клеточного цикла эндотелиальных клеток

Для клеточной линии HUVEC количество живых клеток уменьшилось с 98,23 до 44,70% при применении цис­платина и до 57,83% при использовании H₂O₂. Введение Cлавинорма в среду культивирования позволило восстановить содержание живых клеток до 74,64 и 90,58% соответственно (рис. 3). Сходные изменения наблюдались и в клеточной линии EA.hy926: количество живых клеток снизилось с 97,27 до 42,94% при использовании цисплатина и до 49,82% на фоне применения H₂O₂. Введение Cлавинорма в среду культивирования позволило восстановить содержание живых клеток до 63,22 и 75,79% соответственно.

Для клеточной линии SVEC-4-10 количество живых клеток снижалось с 97,13 до 6,17% при применении цис­платина и до 62,92% при применении H₂O₂. Введение Cлавинорма в среду культивирования позволило восстановить содержание живых клеток до 41,04 и 87,47% соответственно.

Во время фазы G0 клетка находится в состоянии покоя, а в фазе G1 клетка начинает увеличиваться в размерах, синтезировать мРНК и белки и готовиться к митозу. Для клеточной линии SVEC-4-10 доля клеток в состоянии покоя увеличивалась с 25,29 до 49,10% при использовании цисплатина и до 36,72% на фоне применения H₂O₂. Введение Славинорма в среду культивирования позволило увеличить количество клеток, переходящих в фазу подготовки к митозу, что выразилось в снижении доли клеток в фазе покоя при сокультивировании с комбинацией Славинорма и цисплатина до 27,73 и до 30,20% – при сокультивировании с комбинацией Славинорма и H₂O₂ (рис. 4). Полученный результат свидетельствует о том, что меньшее количество клеток остается в фазе покоя и соответственно больший процент эндотелиоцитов активируется для участия в процессах регенерации.

Для клеточной линии HUVEC количество клеток в фазе покоя увеличивалось с 41,06 до 58,72% при использовании цисплатина и до 62,90% на фоне применения H₂O₂. Введение Славинорма в среду культивирования позволило нормализовать распределение клеток по фазам клеточного цикла, что выразилось в снижении доли клеток в фазе покоя до 48,79% при сокультивировании с цисплатином и до 52,57% при сокультивировании с H₂O₂ соответственно.

Изучение влияния препарата на способность эндотелиальных клеток формировать СПС в 3D-культуре

При культивировании на матриксе Матригель эндотелиальные клетки человека и мыши претерпевают дифференцировку и изменение морфологии, формируя сеть из СПС. Контрольная сеть из СПС, сформированная в присутствии VEGF и FGF, отличается большим количеством структурных элементов небольшого размера, имеющих стенки из нескольких слоев эндотелиальных клеток, а также большим количеством узлов ветвления. Сокультивирование эндотелиальных клеток с индукторами повреждения 5 мкг/мл цисплатина или 5 мкМ H₂O₂ вызывает нарушения формирования сети из СПС, заключающиеся в упрощении ее структуры, увеличении количества СПС вне сети, снижении количества структурных элементов сети – «замкнутых» ячеек из СПС, увеличении размеров ячеек, уменьшении количества узлов ветвления.

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение количества структурных элементов сети в поле зрения по сравнению с контрольной группой – 36,4% (рис. 5). Сокультивирование эндотелиальных клеток человека HUVEC c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило частично восстановить структуру сети из СПС (60,5% от контроля). Аналогичные изменения отмечались и при сокультивировании HUVEC c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – снижение количества структурных элементов сети под действием 5 мкМ H₂O₂ (39,6%) и восстановление этой структуры при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (54,1%).

Сокультивирование эндотелиальных клеток человека линии EA.hy926 c 5 мкг/мл цисплатина приводило к статистически значимому снижению количества структурных элементов сети в поле зрения по сравнению с контрольной группой – 33,2%. Сокультивирование эндотелиальных клеток человека EA.hy926 c 5 мкг/мл цис­платина и 50 мкг/мл Славинорма позволило частично восстановить структуру сети из СПС (51,6% от контроля). Аналогичные изменения наблюдались при сокультивировании EA.hy926 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – нарушение структуры сети под действием 5 мкМ H₂O₂ (36,1%) и восстановление при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (47,3%).

Культивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 в присутствии 5 мкг/мл цисплатина вызывало статистически значимое снижение количества структурных элементов сети в поле зрения по сравнению с контрольной группой – 28,2%. Сокультивирование эндотелиальных клеток мыши SVEC-4-10 c 5 мкг/мл цисплатина и 50 мкг/мл Славинорма позволило восстановить структуру сети из СПС (45,6% от контроля). Аналогичные изменения имели место при сокультивировании SVEC-4-10 c 5 мкМ H₂O₂ и в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма – нарушение структуры сети под действием 5 мкМ H₂O₂ (34,1%) и восстановление при сокультивировании в комбинации с 50 мкг/мл Славинорма (48,8%).

Таким образом, препарат Славинорм оказывает протективное действие на процесс формирования сети СПС из эндотелиальных клеток человека и мыши в присутствии индукторов повреждения.

Обсуждение

Атеросклероз как системное сосудистое поражение начинается с повреждения клеток внутренней выстилки сосуда и формирования эндотелиальной дисфункции. В области повреждения запускается процесс клеточной адгезии. Одновременно частицы липопротеинов проникают в субэндотелиальное пространство, окисляются и становятся цитотоксическими, провоспалительными и проатерогенными. Простой адгезии к эндотелию недостаточно, чтобы переносимые кровью моноциты попали в очаг поражения. Необходимо воздействие хемоаттрактантов, таких как окисленные липопротеины низкой плотности и МСР-1 (моноцитарный хемотаксический фактор-1), рецепторы к которому присутствуют у моноцитов и макрофагов. Внутри интимы созревшие макрофаги поглощают атерогенные липопротеины рецептор-зависимым путем, трансформируясь в пенистые клетки. Переполненные атерогенными липопротеинами макрофаги погибают и способствуют формированию некротического, богатого липидами ядра бляшки. Данный патологический механизм приводит к сужению просвета сосуда, нарушая нормальный кровоток [10].

Таким образом, атерогенез запускается в момент повреждения и последующей гибели эндотелиальной клетки. Согласно результатам проведенных исследований, препарат Славинорм на основе регуляторных пептидов восстанавливает регенеративную способность эндотелиоцитов в условиях окислительного стресса и воздействия цитотоксических факторов, нормализуя миграцию клеток, подавляя процесс апоптоза и увеличивая количество живых эндотелиоцитов. Кроме того, добавление препарата Славинорм в среду культивирования позволяет нормализовать распределение эндотелиальных клеток по стадиям клеточного цикла: снижается доля клеток в G0/G1-точке – фазе покоя, что свидетельствует о стимуляции к митотическому делению большего количества клеток.

Атеросклероз характеризуется прогрессирующим течением. Как правило, к моменту проявления клинических симптомов патология уже имеет системный характер. Как показали результаты данного исследования, Славинорм поддерживает процесс инвазии эндотелиальных клеток через полупроницаемую мембрану в присутствии индукторов повреждения, а также стимулирует миграцию эндотелиальных клеток для формирования сети из СПС. Исходя из этих данных, можно предположить, что на фоне окислительного стресса и глубокого повреждения эндотелиальной ткани препарат запускает процесс неоангиогенеза. Следует отметить, что СПС не являются сосудами как таковыми: они не имеют просвета и состоят из клеточного, эндотелиального слоя. Однако способность стимулировать образование таких структур свидетельствует о наличии у препарата специфических ангиотропных свойств.

В клинических исследованиях Славинорм продемонстрировал благоприятный профиль безопасности: частота развития нежелательных явлений у пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей группы Славинорма статистически значимо не отличалась от аналогичного показателя в группе плацебо (p = 0,59983) [8]. Согласно данным настоящего исследования, Славинорм не стимулирует гиперпластических процессов в сосудистой стенке. Интимальная гиперплазия характеризуется утолщением сосудистой стенки за счет гладкомышечных клеток и богатого протеогликанами внеклеточного матрикса, расположенного между эндотелием и внутренней эластичной пластинкой. Для индукции интимальной гиперплазии необходима инициация пролиферации гладкомышечных клеток [11, 12]. В данном исследовании проводилась сравнительная оценка влияния препарата на пролиферативную активность культуры клеток миоцитов мыши линии C₂C₁₂. Установлено, что Славинорм не вызывает индукцию пролиферации миоцитов в применяемых концентрациях.

Полученные данные подтверждают патогенетический механизм действия препарата при атеросклерозе и его ангиопротекторные свойства. В настоящее время препарат зарегистрирован для терапии перемежающейся хромоты у пациентов с заболеваниями артерий нижних конечностей. Однако, учитывая системный характер атеросклероза, перспективным представляется дальнейшее изучение применения Славинорма для лечения данного заболевания [13].

Перспективной представляется и возможность исследования эффективности препарата при ковид-ассоциированном эндотелиите, воспалении внутренней оболочки кровеносных сосудов, характеризующемся острым повреждением эндотелиальных клеток [14].

Выводы

Препарат Славинорм на культурах эндотелиальных клеток человека и мыши демонстрирует специфическую ангиопротекторную и ангиогенную активность. Полученные результаты обосновывают высокую перспективность патогенетического применения препарата при системном заболевании – атеросклеротическом поражении артериальных сосудов.