Биосимиляры аналогов инсулина: что мы должны о них знать

Рисунок. Значения LBGI в ночные часы на разных видах базального инсулина (показаны медианы и квартили)

Особенности синтеза биотехнологических препаратов

Технический прогресс в области биологии и медицины, ускоряющийся с каждым десятилетием, радикально изменил прогноз многих тяжелых заболеваний. Так, в начале прошлого столетия совершенно новые возможности в лечении сахарного диабета (СД) дало открытие инсулина. В 1974 г. был осуществлен полный химический синтез человеческого инсулина [1], а чуть позже появился генно-инженерный человеческий инсулин, который стал первым патентованным препаратом, синтезированным с помощью технологии рекомбинантной ДНК. В 1982 г. он был одобрен для клинического использования [2].

Все современные препараты инсулина относятся к классу лекарственных средств, производимых с помощью биотехнологий. Медицинской биотехнологией называют методы получения лекарств из живых клеток – бактерий, вирусов, дрожжевых грибов, культур клеток различных тканей. В отличие от химического синтеза препаратов процесс создания биоинженерных препаратов гораздо более чувствителен к деталям технологии: требуются тщательный выбор и очистка субстрата, точнейшее соблюдение температурного режима, использование строго определенных концентраций растворов и т.д.

Препараты, синтезируемые химическим путем, имеют сравнительно простую химическую структуру и способ производства. Воспроизведенная копия такого препарата (дженерик) должна содержать активное вещество с той же молекулярной структурой и физико-химическими, фармакокинетическими свойствами, иметь такую же активность, лекарственную форму и путь введения, что и оригинальный препарат. Из-за хорошей воспроизводимости технологии получения химических лекарств доказательства биоэквивалентности достаточно, чтобы считать дженерик идентичным оригинальному препарату, дополнительных клинических испытаний не требуется [3]. Поэтому для дженериков предусмотрена сокращенная процедура регистрации, что приводит к снижению их себестоимости.

Иначе обстоит дело с биотехнологическими препаратами. Воспроизвести точную копию молекулы такого препарата практически невозможно, так как биоинженерные препараты представляют собой белки. Белки имеют высокую молекулярную массу (в 100–1000 раз больше, чем у обычных химических препаратов) и крайне сложную структуру молекулы, включающую первичный, вторичный, третичный и иногда четвертичный уровни. В процессе формирования пространственной структуры, отвечающей за биологические свойства, молекула белка значительно модифицируется за счет внутримолекулярных сшивок, вырезаний частей молекулы, присоединения различных химических групп. Именно поэтому даже очищенный оригинальный препарат неоднороден и представлен целым рядом белковых молекул, незначительно различающихся между собой [4], а малейшие изменения технологии синтеза могут существенно изменить биологические свойства конечного продукта [5].

Кроме того, культуры клеток, в которых происходит биосинтез, высоко изменчивы. Внедрение в клетку нужного фрагмента ДНК каждый раз приводит к получению несколько отличной рекомбинантной ДНК. Однажды созданная линия рекомбинантных клеток уникальна. Эта линия дает начало оригинальному банку клеток, к характеристикам которого приспосабливается весь дальнейший процесс производства препарата [5, 6]. Следовательно, получить точную копию биопрепарата, используя другой банк клеток, принципиально невозможно.

Биосимиляры

Истечение срока патентной защиты оригинального биопрепарата открывает возможность для создания его версии, или биосимиляра (англ. biological drug – биологический препарат и similar – похожий). Биосимиляр – это воспроизведенное при помощи биотехнологий лекарственное средство, схожее с оригинальным биотехнологическим лекарственным средством и представленное на регистрацию по истечении срока действия патента оригинального лекарственного средства.

Это различие важно понимать, назначая неоригинальные синтетические и биотехнологические препараты.

Биосимиляры – это не дженерики. Та степень сходства, которая существует между оригинальным химическим препаратом и его дженериком, недостижима в области биотехнологических продуктов. Введение отдельного термина для версий биопрепаратов жестко разграничивает группы воспроизводимых препаратов.

Последствия, к которым может привести отличие структуры биосимиляра от структуры соответствующего оригинального препарата, непредсказуемы. Имеются данные о развитии смертельно опасного осложнения после небольшого изменения технологии производства рекомбинантного эритропоэтина [7]. Именно поэтому европейские специалисты отмечают, что сокращенная процедура регистрации, принятая для дженериков, неприемлема для биосимиляров [8, 9].

Впервые термин «биосимиляр» и его определение появились в 2003 г. в директиве Европейского союза, где подчеркивалась важность отличий биосимиляров от дженериков [10]. Впоследствии Европейское агентство по лекарственным средствам (European Medicines Agency – EMA) разработало ряд руководств, касающихся биопрепаратов и биосимиляров, которые регулярно пересматриваются и обновляются [11–13]. Данные руководства содержат требования к проведению доклинических и клинических исследований биосимиляров [12], оценке иммуногенности [13] и др. Согласно требованиям EMA биосимиляр прежде всего должен обладать высокой степенью сходства с оригинальным препаратом как по физико-химическим, так и по биологическим свойствам. Рекомендуется ступенчатый подход к сравнению оригинальных препаратов и биосимиляров, включающий доклинические и клинические этапы. При этом объем исследований на каждом следующем этапе зависит от результатов предыдущего [12]. Принципы, заложенные в этих документах, отразились в законодательстве некоторых стран.

Российская законодательная база по биосимилярам в настоящее время находится на стадии разработки. В 2013 г. была опубликована позиция Российской ассоциации эндокринологов в отношении биологических препаратов [14]. Проект федерального закона «О внесении изменений в Федеральный закон № 61 “Об обращении лекарственных средств”», касающийся создания нормативно-правовой базы по регистрации лекарственных препаратов, сначала обсуждался в рамках экспертной сессии, посвященной проблеме биосимиляров (2014) [15], а затем публично. После этого в Федеральном законе № 61 были сделаны соответствующие поправки и изменения. Так, в ст. 4 появились термины «биологический лекарственный препарат», «биоаналоговый лекарственный препарат (биоаналог)», «препарат сравнения», «взаимозаменяемые лекарственные препараты». В ноябре 2014 г. законопроект был принят Госдумой во втором чтении, в декабре подписан Президентом РФ. Предполагается, что большинство норм закона вступят в силу с 2016 г. [16, 17].

Биосимиляры человеческого инсулина и его аналогов: подтверждение соответствия

В настоящее время проблемы создания и оценки эффективности биосимиляров особенно актуальны для аналогов человеческого инсулина.

С начала 2000-х гг. целый ряд компаний начал производство неоригинальных препаратов рекомбинантного человеческого инсулина в странах, где регулирующие правовые нормы в отношении биопрепаратов не были развиты или отсутствовали. Так, в Польше был выведен на рынок Генсулин, в Индии – Инсуген, Восулин, Биосулин N, Биосулин R и Биосулин 30/70 [2].

В России также используются препараты рекомбинантного инсулина человека различных производителей. Сравнительный анализ их фармакокинетических характеристик показал, что разные препараты инсулина с одинаковым международным непатентованным наименованием имеют колоссальные различия по времени начала действия, пику и продолжительности действия, а также составу дополнительных ингредиентов [18], что, несомненно, влияет на эффективность инсулинотерапии.

Именно поэтому для биосимиляров инсулина EMA рекомендует проведение следующего минимума клинических исследований [19]:

• фармакокинетики – не менее одного однодозового перекрестного исследования с подкожным введением, предпочтительно у пациентов с СД 1 типа;
• фармакодинамики. Проведение тестов, демонстрирующих эквивалентность инсулинов, в частности двойных слепых перекрестных исследований с использованием эугликемического гиперинсулинемического клэмпа, отражающих соотношение «время – эффект», с предоставлением данных о скорости инфузии глюкозы и концентрации инсулина, а также обоснованием выбора популяции;
• эффективности биосимиляра и оригинального инсулина (достаточно сравнить уровень гликированного гемоглобина (HbA1c));
• иммуногенности инсулина (продолжительность исследования не менее шести месяцев).

В настоящее время биосимиляры аналогов инсулина, в том числе инсулина гларгина, получили доступ на рынок в таких странах, как Китай, Индия, Пакистан, Перу, Таиланд, Мексика и Кения [2, 6]. В большинстве из них версии инсулина зарегистрированы без соблюдения требований к демонстрации идентичности оригинальному препарату Лантус (компания «Санофи») [6].

Так, в Китае эффективность Базалина (препарата, позиционируемого как «отечественный» гларгин) и его биоэквивалентность Лантусу были установлены только на основании результатов эугликемического клэмпа у здоровых добровольцев. В другом исследовании биоэквивалентность воспроизведенного в Китае препарата и оригинального гларгина была установлена на основании показателей тощаковой и постпрандиальной гликемии у пациентов с СД 2 типа при применении инсулина в комбинации с пероральными сахароснижащими препаратами. В 2006 г. производство Базалина начато китайско-корейской корпорацией. В 2009 г. в Колумбии заявка местного производителя на регистрацию Базалина была отклонена в связи с отсутствием иммуногенетических исследований [2].

Гларитус, один из первых биосимиляров гларгина, был зарегистрирован в Индии (компания «Вокхард») в 2009 г. [20]. В настоящее время его иммуногенность и безопасность по сравнению с Лантусом еще оцениваются в рандомизированном открытом исследовании фазы III с участием пациентов с СД 1 типа (NCT01352663). Завершение работы планируется не раньше января 2016 г. [21]. Для демонстрации биоэквивалентности Гларитуса Лантусу проводилось сравнительное исследование фазы I с использованием клэмп-методов (NCT01357603). Исследование завершено в августе 2012 г., однако его результаты пока не опубликованы [22].

Еще одна неоригинальная версия гларгина, которая производится в Индии с 2009 г. компанией «Биокон», – препарат Базалог. В многоцентровом рандомизированном открытом исследовании фазы III с участием 215 пациентов с СД 1 типа было показано, что применение Базалога и Лантуса позволяет достичь сравнимого гликемического контроля. Такое заключение сделано на основании уровня HbA1c, частоты эпизодов гипогликемии, тощаковой и постпрандиальной гликемии. Однако в протоколе исследования не предусматривалось проведения эугликемического клэмпа [23].

Из аналогов инсулина длительного действия потенциальным образцом для создания биосимиляров являются гларгин и детемир. Однако данные о разработке версий последнего пока отсутствуют. При этом имеются сведения о попытках создать версии аналогов инсулина ультракороткого действия, таких как лизпро и аспарт [6].

Вариабельность действия аналогов инсулина и биосимиляров

Известно, что метаболические эффекты, индуцированные одной и той же дозой инсулина, существенно различаются у разных людей (межиндивидуальная вариабельность действия) и даже у одного человека (интраиндивидуальная вариабельность действия). Данные различия могут быть связаны с особенностями скорости абсорбции и метаболизма инсулина (фармакокинетический аспект вариабельности), а также действия инсулина на чувствительные клетки (фармакодинамический аспект). Для оценки фармакокинетической вариабельности определяют концентрацию инсулина в плазме крови, для оценки фармакодинамической вариабельности применяют клэмп-методы.

Высокая вариабельность кинетики и действия инсулина затрудняет подбор дозы и повышает риск развития гипогликемий [24]. Именно поэтому EMA требует при сравнении биосимиляра с оригинальным инсулином приводить результаты эугликемического гиперинсулинемического клэмпа, в том числе временной профиль введения раствора глюкозы [19].

В исследованиях с использованием клэмп-методов у гларгина по сравнению с НПХ-инсулинами было показано более раннее начало и более равномерный профиль действия c достижением стабильного плато [25]. У больных СД 1 типа межиндивидуальная фармакокинетическая и фармакодинамическая вариабельность гларгина в дозе 0,3 ЕД/кг была достоверно ниже таковой НПХ-инсулина (р < 0,05) и оказалась сравнима с вариабельностью эффекта подачи инсулина в режиме непрерывной подкожной инфузии [26].

С вариабельностью действия инсулина связана вариабельность гликемии (ее колебания в течение суток), для оценки которой сегодня существует около 30 различных методов [27]. Так, в многоцентровом исследовании, включавшем 116 больных СД 2 типа (уровень HbA1c 4,5–8%), оценивалось влияние перевода с НПХ-инсулина на гларгин на показатели вариабельности гликемии, рассчитанные по данным непрерывного мониторинга. После перевода на гларгин наблюдалось значительное увеличение площади под кривой гликемии (AUC), ограниченной нормальными значениями, уменьшение AUC в зоне гипергликемии, а также снижение суточных колебаний уровня глюкозы [28].

При оценке действия пролонгированных аналогов инсулина наиболее показательны данные по вариабельности гликемии в ночные часы и натощак. Так, анализ показателей ночной вариабельности гликемии, в частности высокочувствительного индекса риска гипогликемии (low blood glucose index – LBGI), у пациентов с СД 2 типа, получавших гларгин (n = 27) и НПХ-инсулин (n = 22), продемонстрировал значительное снижение LBGI на фоне применения гларгина по сравнению с НПХ-инсулином (p = 0,04) (рисунок) [29].

Таким образом, снижение вариабельности гликемии, достигаемое за счет снижения вариабельности действия препарата, – одно из главных преимуществ гларгина перед пролонгированными человеческими инсулинами. Это служит основанием для перевода на гларгин тех пациентов, у которых отмечаются резкие колебания гликемии.

Однако можно ли утверждать, что описанный эффект будет выражен в той же степени у биосимиляров гларгина?

Феномен вариабельности действия разных препаратов одного и того же инсулина обусловлен рядом факторов. Первый – особенности производства и хранения инсулина.

Производство инсулина – сложный многостадийный процесс, включающий [6, 18]:

1) подготовку отрезка ДНК, кодирующей молекулу инсулина (вектора);

2) выбор платформы или «хозяина», то есть тех клеток, в ДНК которых будет интегрирован вектор и которые затем будут производить инсулин. Обычно это бактерии (Escherichia coli) или грибы (Saccharomyces cerevisiae или Pichia pastoris);

3) трансфекцию, то есть перенос векторной ДНК в генетический аппарат «хозяина»;

4) отбор клеток и выделение клеточной линии, содержащих рекомбинантную ДНК;

5) культивирование клеток в питательной среде, в которой нарабатываются продукты их жизнедеятельности, в том числе белок, закодированный векторной ДНК;

6) извлечение и очистку продукта от С-пептида (при использовании E. coli);

7) формирование вторичной структуры инсулина путем образования дисульфидных мостиков и отщепления ненужных аминокислотных последовательностей (при использовании E. coli, при использовании грибов белок секретируется в питательную среду уже сформированным в нужную пространственную структуру);

8) очистку и концентрацию с использованием кристаллизации и хроматографии, лиофилизацию, изготовление лекарственной формы.

На любой стадии производства белкового препарата могут появиться различия, затрагивающие как первичную структуру молекулы, так и ее финальную пространственную упаковку, определяющую биологические свойства. Кроме того, возможно образование побочных продуктов, связанных с экспрессией вектора и ведущих к различиям в процессинге белка (например, окисление и гликозилирование). Так, для производства Лантуса, оригинального гларгина, в качестве платформы используется E. coli, а для синтеза Базалога – грибы Pichia pastoris. Это приводит к прикреплению трех дополнительных полисахаридных остатков к молекуле Базалога.

Известно, что другие различия в используемых материалах и методах биосинтеза и хранения продукта (условия культивации, состав питательной среды, дизайн оборудования) также вносят вклад в вариабельность свойств конечного продукта [6].

Еще одна важная задача – сохранить неизменность препарата. Данные кристаллографии свидетельствуют, что позиция А21 в молекуле инсулина аргинин-B31-аргинин-B32 вовлекается в несколько межгексамерных контактов. Замена аспарагина в позиции А21 на глицин (глицин A21) привела к уменьшению количества межгексамерных связей, то есть меньшей кристаллизации, что обеспечило стабильность при длительном хранении [1].

Проводилось сравнение уровня белков с высокой молекулярной массой (high molecular weight proteins – HMWP) до и после хранения при температуре +25 °C в оригинальном и неоригинальных препаратах гларгина. Оказалось, что уровень HMWP исходно находился в пределах допустимых значений во всех образцах, через 28 дней хранения он значительно превышал норму в образцах Гларитуса и Базалина, оставаясь практически неизменным в образце Лантуса [6].

Второй фактор вариабельности действия – техника инъекции инсулина. Биосимиляры аналогов инсулина, как правило, поставляются на рынок с собственными устройствами для введения (инъекторами, или шприц-ручками). Согласно руководству EMA устройства для введения инсулина также подлежат жесткому контролю качества [30].

Не так давно проведены испытания инъекторов Pen Royale и DispoPen, предназначенных для введения Гларитуса, инъектора GanLee Pen для Базалина, инъекторов ClikSTAR и SoloSTAR для Лантуса. Показано, что неоригинальные устройства имеют более высокий коэффициент вариации при введении определенных доз инсулина. Сила, необходимая для инъекции инсулина, оказалась выше у инъекторов, предназначенных для введения биосимиляров [31].

Иммуногенная и митогенная активность аналогов инсулина и биосимиляров

Инсулин, как и любой биопрепарат, может вызывать реакцию иммунной системы. Среди возможных причин выделяют измененную структуру белка действующего вещества и наличие примесей (например, фрагментов клеток-продуцентов или продуктов реакции с вспомогательными веществами). Иммунная реакция может проявляться по-разному – от выработки антител, не снижающих эффективность терапии, до полной нейтрализации и инактивации инсулина антителами.

Есть предположение, что основная причина выработки антител на рекомбинантный человеческий инсулин – его способность к агрегации в мультимеры. Возможной причиной агрегации считается взаимодействие инсулина с покрытиями, встречающимися в процессе производства, хранения и введения. Агрегаты усиливают иммуногенность экзогенного инсулина, изменяя толерантность В-лимфоцитов, так как представляют повторяющиеся эпитопы, «напоминающие» бактериальные антигены и вызывающие образование специфических антител [6, 32].

ΕΜΑ предписывает тщательно изучать иммуногенность биопрепаратов [13]. При этом первичной конечной точкой является формирование антител к биопрепарату. В настоящее время иммуногенные свойства большинства биосимиляров изучены недостаточно.

Как и человеческий инсулин, гларгин оказывает метаболический и рост-стимулирующий (митогенный) эффекты в клетках-мишенях. Митогенный эффект реализуется главным образом через рецепторы инсулиноподобного фактора роста 1 (ИФР-1). Известно, что в условиях in vitro способность гларгина вызывать активацию (аутофосфорилирование) рецептора ИФР-1 в пять – восемь раз выше, чем у нативного инсулина. Однако в условиях in vivo избыточной стимуляции рецептора ИФР-1 не происходит. Дело в том, что в организме гларгин трансформируется с образованием двух основных метаболитов – M1 и M2, а также промежуточного продукта IM. Сначала с карбоксильного конца В-цепи удаляется остаток аспарагина (образуется промежуточный метаболит IM), далее – еще один аспарагиновый остаток с того же конца, при этом В-цепь становится идентичной таковой в молекуле инсулина человека (метаболит М1). Биотрансформация начинается уже в месте инъекции и значительно ускоряется в плазме [24]. В итоге основным метаболитом гларгина является M1: он быстро попадает в кровоток и его концентрация в течение 24 часов преобладает над концентрацией интактного гларгина и всех других метаболитов [33, 34]. Отщепление дополнительных аргининовых остатков в процессе биотрансформации нивелирует повышенную способность гларгина к стимуляции рецептора ИФР-1 [33, 35].

Последние эксперименты на двух линиях клеток рака молочной железы человека (MCF-7), в различной степени экспрессирующих рецептор ИФР-1 и инсулиновый рецептор, показали, что пролиферативный эффект гларгина не отличается от эффекта человеческого инсулина и других инсулиновых аналогов. Митогенные свойства, связанные с активацией сигнального пути ИРФ-1, не сопровождались усилением пролиферативного ответа из-за быстрого превращения гларгина в метаболиты М1 и М2 [36]. Анализ результатов экспериментальных исследований, посвященных митогенным свойствам инсулиновых аналогов, продемонстрировал, что пролиферативный и онкогенный потенциал гларгина не отличается от потенциала инсулина человека [37].

Согласно требованиям EMA в обязательные доклинические тесты в ходе испытаний препаратов инсулина должны включаться биоанализ аффинности в условиях in vitro, анализ содержания инсулина и связывания с рецепторами ИФР-1, а также влияния на пролиферацию клеток [18]. Для известных в настоящее время биосимиляров гларгина результаты подобных исследований еще не получены [20, 21, 38].

Данные последних клинических исследований свидетельствуют о сходном риске развития онкологических заболеваний при лечении гларгином и другими инсулинами. Метаанализ 29 рандомизированных клинических исследований фаз II–IV, включавших в общей сложности 10 880 больных СД 1 и 2 типа, из которых 5657 получали гларгин, показал, что терапия данным аналогом не ассоциирована с увеличением частоты злокачественных новообразований [39]. Исследование ORIGIN, наиболее масштабное по количеству участников (12 537 человек) и длительности наблюдения (6,2 года), также не выявило каких-либо изменений в частоте развития рака и смертей от онкологических заболеваний у лиц с дисгликемией, получавших гларгин (по сравнению со стандартным лечением) [40]. Онкогенный потенциал биосимиляров гларгина еще необходимо изучать.

Заключение

Анализ приведенных данных свидетельствует о возможности существенных различий фармакокинетических и фармакодинамических свойств пролонгированных аналогов инсулина и их биосимиляров. Биосимиляр аналога инсулина может безопасно заменить оригинальный препарат только в том случае, если он имеет сопоставимую вариабельность действия, а его онкогенные и иммуногенные свойства изучены в клинических исследованиях.

Между тем в системах здравоохранения ряда стран, включая Россию, практикуется автоматическая замена оригинальных препаратов инсулина на биосимиляры, априори считающиеся эквивалентами. Подобная практика, по выражению L. Heinemann, напоминает огромный эксперимент, в котором участники не давали согласия на участие и не были информированы о возможных последствиях [8].

Гларгин – первый и наиболее изученный длительно действующий аналог инсулина, способный удовлетворять потребность в базальном инсулине на протяжении 24 часов. Эффективность и безопасность оригинального препарата гларгина (Лантуса) доказана многочисленными клиническими исследованиями. Однако вариабельность эффекта, иммуногенные и митогенные свойства биосимиляров гларгина изучены недостаточно.

В настоящее время очевидна необходимость введения специального регулирования обращения биосимиляров в Российской Федерации, установления комплексных требований к определению их эффективности и безопасности по каждому показанию, осуществления специальных мер по фармаконадзору, особенно в отношении отслеживания иммуногенности в долгосрочном периоде, формирования базы данных по безопасности уже обращающихся и вновь регистрируемых препаратов. Такой подход, зафиксированный в позиции экспертов Российской ассоциации эндокринологов [14], может служить основой для принятия решения о возможности применения и взаимозаменяемости тех или иных биосимиляров аналогов инсулина.