Интегративные модели оценки риска развития рецидива немышечно-инвазивного рака мочевого пузыря

Таблица 1. Клинико-морфологические параметры в зависимости от характера течения НМИРМП

Таблица 2. Показатели клеточного цикла в зависимости от характера течения НМИРМП Ме (С25–С75)

Введение

По данным мировой статистики, рак мочевого пузыря является достаточно распространенной опухолью, занимающей 9-е место в общей структуре онкологической заболеваемости и имеющей тенденцию к постоянному росту. На долю рака мочевого пузыря приходится около 2–5% всех злокачественных новообразований и 30–40% опухолей мочеполовой системы. 75–80% всех случаев заболевания составляет немышечно-инвазивный рак мочевого пузыря (НМИРМП) [1, 2].

Несмотря на использование комбинированных и комплексных методов, лечение НМИРМП остается проблематичным в силу склонности заболевания к рецидивирующему течению [3, 4]. Диагностике рецидива заболевания посвящено множество работ, направленных на поиск клинико-морфологических, цитологических и молекулярных предикторов течения заболевания. Тем не менее до сих пор актуальны исследования, направленные на создание диагностически точных моделей, определяющих риск развития рецидива НМИРМП [5, 6].

Цель данной работы – создание высокочувствительных и специфичных математических моделей прогнозирования риска развития рецидива у больных НМИРМП на основании клинико-морфологических параметров и показателей клеточного цикла осадка мочи.

Материал и методы

Работа проводилась на базе КГБУЗ «Красноярский краевой клинический онкологический диспансер им. А.И. Кры­жановского». В исследовании участвовало 162 больных НМИРМП (средний возраст – 63,7 ± 10,30 года). Пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 113 пациентов, у которых отсутствовал рецидив заболевания на протяжении 36 месяцев с момента окончания лечения, вторую – 49 больных НМИРМП с подтвержденным рецидивом заболевания, возникшим в течение трехлетнего периода наблюдения.

В указанных группах изучались клинико-морфологические показатели: клинические проявления заболевания, размеры опухоли, их количество, глубина инвазии, степень дифференцировки и локализация опухоли.

Для изучения клеточного цикла в осадке мочи у всех пациентов забиралась утренняя порция мочи. Для выделения клеточных элементов осадка исследуемую порцию мочи центрифугировали при 2000 об/мин в течение 20 минут. После этого дважды проводили процедуру отмывки клеточного осадка фосфатным буферным раствором.

Клеточный цикл определяли в подготовленном клеточном осадке мочи методом флуоресцентного окрашивания ki-67 и йодидом пропидия. Пермебализацию клеточных элементов осуществляли с использованием 96%-ного этилового спирта. Флуоресцентное окрашивание ki-67 проводили моноклональными антителами, меченными флуоресцеина изотиоцианатом (ФИТЦ, максимум поглощения на 492 нм, максимум флуоресценции на 518 нм, производитель BD Biosciences, США). После добавления йодида пропидия (фенантридин-3,8-диамино-5-[3-(диэтилметиламмоний) пропил]-6-фенил-дийодид, максимум поглощения на 488 нм, максимум флуоресценции на 610 нм, производитель Sigma-Aldrich, США) и инкубации измеряли флуоресценцию на проточном цитофлуориметре BD FACSCantoII (Becton Dickinson, США).

Статистическую обработку данных выполняли с помощью компьютерных программ Мicrosoft Office Excel 2013, IBM SPSS 20.0.

При оценке нормальности распределения количественных признаков ориентировались на критерий Шапиро – Уилка. Для межгрупповых сравнений использовали непараметрический критерий Манна – Уитни. По качественным признакам сравнение групп проводили на основании критерия χ² Пирсона. Уровень отвержения статистической гипотезы относительно незначимости различий между переменными р < 0,05.

Показатели безрецидивной выживаемости больных НМИРМП оценивали методом анализа дожития по Каплану – Мейеру. Цензурированными при проведении анализа считали случаи дожития пациентов до конца трехлетнего (36-месячного) срока наблюдения в отсутствие признаков рецидива.

Для создания прогностических моделей использованы методы дискриминантного и множественного регрессионного логистического анализа. Специфичность и чувствительность полученных логистических регрессионных и дискриминантных моделей оценивали с помощью ROC-анализа. Количественную интерпретацию результатов проводили по ROC-кривым, оценивая показатель AUC (Area Under Curve – площадь под ROC-кривой).

Результаты

Данные, полученные при сравнительной оценке основных клинико-морфологических параметров у больных НМИРМП в зависимости от характера течения заболевания, представлены в табл. 1.

При изучении клинических признаков установлено, что у пациентов второй группы (с рецидивом заболевания) гематурия встречалась в 2,2 раза чаще (р < 0,05), чем у больных без рецидива. При этом дизурия и болевой сидром не имели статистически значимых различий в сравниваемых группах.

При анализе размеров опухоли выявлено, что размер опухоли 0,5–1 см у пациентов второй группы регистрировался в 2,2 раза (р < 0,05) чаще, чем у пациентов первой группы. Размеры опухоли более 1,0 см не имели статистически значимых различий в сравниваемых группах.

Анализ количества опухолей у больных НМИРМП показал, что одно образование чаще отмечалось у пациентов без рецидива заболевания по сравнению с пациентами с рецидивом (р < 0,05). В свою очередь мультицентричный рост опухоли в 3,1 раза (р < 0,01) чаще наблюдался у пациентов второй группы.

При анализе глубины инвазии опухоли в стенку мочевого пузыря выявлено значимое увеличение в 5,3 раза (р < 0,05) числа пациентов с ТIS по сравнению с пациентами без рецидива заболевания.

При оценке локализации опухоли в мочевом пузыре у пациентов с НМИРМП установлено, что опухоль боковой стенки мочевого пузыря в 2,4 раза (р < 0,05) чаще регистрировалась у пациентов первой группы по сравнению с пациентами второй группы. При этом мультицентричный рост опухоли был более характерен для пациентов с рецидивирующим течением заболевания (р < 0,05).

Анализ степени дифференцировки опухоли мочевого пузыря показал статистически значимые различия только при 3-й степени клеточной анаплазии (G3), которая чаще отмечалась у пациентов второй группы (р < 0,05).

Таким образом, анализ клинико-морфологических параметров у больных НМИРМП исследуемых групп продемонстрировал наличие ряда показателей, ассоциированных с рецидивирующим течением заболевания. Речь идет о гематурии, небольшом размере опухоли, мультицентричности опухолевого роста, ТIS, локализации опухолевого поражения на боковых стенках, низкой степени дифференцировки опухоли.

При сравнительном анализе показателей митотического цикла у пациентов с различным течением НМИРМП обнаружено увеличение количества клеток в S-фазе (70,15 ± 6,58) на фоне рецидивирующего течения заболевания (по сравнению с группой без рецидива) (р < 0,05). Кроме того, имела место тенденция к снижению доли клеток в G0-фазе у пациентов второй группы (0,05 < р < 0,1) (табл. 2).

Следующим этапом работы стало определение переменных, позволяющих прогнозировать развитие рецидива у больных НМИРМП с помощью дискриминантного анализа. В качестве предикторов использовались указанные клинико-морфологические параметры, а также показатели клеточного цикла осадка мочи. Методом шагового отбора были выбраны следующие предикторы развития рецидива НМИРМП: относительное количество клеток в осадке мочи, находящихся в S- и G0-фазах клеточного цикла, общее количество опухолей в мочевом пузыре и наличие гематурии. Наибольший вклад в результаты классификации из отобранных переменных вносят количество опухолей и наличие гематурии. Эти же признаки в большей степени коррелируют с канонической дискриминантной функцией.

Исходя из данных, линейная дискриминантная функция, прогнозирующая низкий риск развития рецидива НМИРМП после комбинированного лечения, представлена уравнением:

D1 = -49,810 + 1,322x1 + 0,251x2 + 1,665x3 + 3,764x4.

Уравнение линейной дискриминантной функции, прогнозирующей высокий риск рецидива заболевания, имеет вид:

D2 = -53,945 + 1,380x1 + 0,185x2 + 2,486x3 + 1,962x4, 

где 
D1 и D2 – линейные дискриминантные функции;

х1 – доля клеток осадка мочи в S-фазе клеточного цикла;

х2 – доля клеток осадка мочи в G0-фазе клеточного цикла;

х3 – мультицентричность опухоли;

х4 – гематурия (0 – отсутствие, 1 – наличие).

При D1 > D2 прогнозируется низкий риск развития рецидива НМИРМП, при D1 < D2 – высокий.

Чувствительность данной модели – 79,6%, специфичность – 72,6%, общая диагностическая точность – 74,6%.

В качестве другого метода оценки вероятности развития рецидива НМИРМП использовали множественный логистический регрессионный анализ.

Для повышения точности модели была предпринята попытка использовать наряду с показателями клеточного цикла осадка мочи в качестве предикторов клинико-морфологические параметры.

Методом шагового отбора получена логистическая регрессионная модель, представленная следующим уравнением:

,

где
р – вероятность развития рецидива НМИРМП;

х1 – доля клеток осадка мочи в S-фазе клеточного цикла;

х2  – доля клеток осадка мочи в G0-фазе клеточного цикла;

х3  – наличие гематурии
(0 – отсутствие, 1 – наличие);

х4 – количество опухолей
(b4 = 0,729).

При р < 0,5 прогнозировался низкий риск развития рецидива НМИРМП, при р ≥ 0,5 – высокий.

Модель имеет хорошую согласованность данных (по Хосмеру – Лемешоу р = 0,820) и является статистически значимой (χ² = 51,526; р < 0,001).

Для данной модели коэффициент детерминации R² = 0,386, что показывает статистически значимое объяснение данными предикторами изменений переменной отклика на 38,65%. Модель с высокой специфичностью предсказывает отсутствие рецидива после комбинированного лечения НМИРМП (в 91,2% случаев). При этом доля правильных предсказаний развития рецидива достигла 69,4%.

С учетом ROC-анализа наиболее точной прогностической моделью по достигнутому уровню чувствительности и специфичности является регрессионная модель, использующая в качестве предикторов рецидива рака мочевого пузыря сочетание показателей митотического цикла и клинических признаков. Модель характеризуется высокой специфичностью – 91,2%, чувствительностью 69,4%, общей диагностической точностью 84,5%.

Обсуждение

В 8-м издании TNM [7] в качестве основных прогностических факторов при немышечно-инвазивном раке мочевого пузыря указаны степень злокачественности, категория Т, carcinoma in situ, количество новообразований, предшествующие рецидивы, возраст, общее состояние, сопутствующие заболевания, объем трансуретральной резекции. К дополнительным факторам отнесены размеры опухоли, рецидив образования при обследовании через три месяца, пол и курение. Проведенный нами сравнительный анализ идентифицировал аналогичные прогностические факторы: размер и количество опухолей, наличие carcinoma in situ, низкую степень дифференцировки опухоли.

Кроме того, используемые онкологами для оценки риска рецидива и прогрессирования НМИРМП классификация EORTC [8] и схема Испанской группы онкоурологов (CUETO) [9], основанные на количестве новообразований, степени их дифференцировки, размерах, стадии и числе рецидивов, демонстрируют недостаточную диагностическую точность [10, 11]. Приведенные данные свидетельствуют о необходимости разработки новых интегративных моделей, основанных на наиболее значимых и хорошо изученных клинико-морфологических параметрах, а также новых факторах, связанных с биологическими особенностями опухолевого роста. К таким факторам можно отнести параметры клеточного цикла.

Ранее проведенные исследования продемонстрировали роль различных фаз клеточного цикла в диагностике и оценке риска развития рецидива у пациентов со злокачественными новообразованиями [12, 13]. В исследовании Е.В. Слепова и соавт. показано, что количество клеток во всех фазах клеточного цикла статистически значимо отличается у пациентов с уротелиальной карциномой по сравнению с пациентами без признаков опухолевого или воспалительного поражения мочевых путей [14].

Увеличение доли клеток, находящихся в процессе деления, отражает интенсивные пролиферативные процессы, связанные с развитием злокачественного новообразования. Данное предположение также подтверждается изменениями относительного количества клеток, находящихся в фазах клеточного цикла до и после митоза. В свою очередь снижение доли клеток осадка мочи, находящихся в синтетической фазе, возможно, характеризует перерас­пределение всего клеточного пула в сторону активной пролиферации. Клетки, находящиеся в G0-фазе клеточного цикла, максимально направлены на выполнение определенной функции. Поэтому относительное содержание этих клеток может отражать уровень дифференцировки исследуемой ткани. С этой точки зрения снижение доли клеток, находящихся в периоде покоя, закономерно предшествует рецидивированию опухоли в дальнейшем [15].

Обнаруженные изменения согласуются с существующими теориями канцерогенеза в тканях мочевого пузыря [16, 17]. То, что в группе с рецидивирующим течением НМИРМП доля клеток осадка мочи, находящихся в синтетической фазе, больше, чем в группе без рецидива, может объясняться более активными пролиферативными процессами в уротелии.

Заключение

Сравнительный однофакторный анализ основных клинико-морфологических параметров и показателей клеточного цикла у больных НМИРМП выявил возможные предикторы рецидива заболевания: наличие гематурии и участков carcinoma in situ, размер опухоли от 0,5 до 1,0 см, мультицентричность опухолевого роста, локализацию поражения на боковых стенках мочевого пузыря, низкую степень дифференцировки опухоли, а также увеличение количества клеток осадка мочи в S-фазе.

При проведении дискриминантного анализа методом шагового отбора были отобраны следующие предикторы развития рецидива НМИРМП: относительное количество клеток в осадке мочи, находящихся в S- и G0-фазах клеточного цикла, общее количество опухолей в мочевом пузыре и наличие гематурии. Чувствительность данной модели составила 79,6%, специфичность – 72,6%, диагностическая точность – 74,6%.

Регрессионная модель Кокса идентифицировала в качестве статистически значимых предикторов рецидива заболевания удельный вес клеток осадка мочи в S-фазе и G0-фазе митотического цикла. Кроме того, точность модели значительно повышалась при включении таких клинико-морфологических показателей, как количество опухолей и наличие гематурии. Модель характеризовалась высокой специфичностью – 91,2%, чувствительностью 69,4%, общей диагностической точностью 84,5%.

Таким образом, разработанные с использованием различных математических методов интегративные модели установили в качестве статистически значимых предикторов рецидива НМИРМП схожие показатели: повышение удельного веса клеток осадка мочи в S-фазе, снижение их в G0-фазе, наличие гематурии и мультицентричность опухолевого роста.