Исследование бактериального сообщества толстой кишки при язвенном колите: микробиота как потенциальный маркер эффективности терапии

Рис. 1. Представленность типов бактерий в исследуемых группах

Рис. 2. Представленность наиболее часто регистрируемых родов бактерий в исследуемых группах

Таблица 1. Результаты многофакторного анализа влияния бактериальной микробиоты толстой кишки на ремиссию ЯК (логистическая регрессия)

Рис. 3. ROC-кривая для модели прогнозирования ремиссии ЯК на основании данных о представленности родов микробов

Введение

Язвенный колит (ЯК) – хроническое, неспецифическое и полиэтиологичное заболевание, поражающее толстую кишку и классифицируемое как воспалительное заболевание кишечника (ВЗК) [1]. Патогенез ВЗК определяется сложными взаимодействиями между генетической предрасположенностью, факторами окружающей среды, микробиотой и нарушением регуляции иммунного ответа.

Микробное сообщество толстой кишки включает бактерии, простейшие, археи, грибы и вирусы, представляя крупнейший резервуар микробиома человека [2–4]. С учетом разнообразия, сложности, избыточности и взаимодействия с организмом-хозяином толстокишечная микробиота является обширной и стабильной экосистемой [4]. Ее здоровое функционирование способствует метаболизму питательных веществ, ксенобиотиков и лекарств, сохранению структурной целостности барьера слизистой оболочки (СО) кишечника, иммуномодуляции и защите от патогенов [5].

Бактериальная микробиота является наиболее обширным компонентом кишечной микробной флоры и насчитывает около 100 триллионов микроорганизмов и более 1000 видов, большинство из которых принадлежат к доминирующим типам Bacteroidetes, Firmicutes, Proteobacteria и Actinobacteriota [6]. Изменения в структуре или функции микробиотического сообщества и нарушение микроэкологического гомеостаза – состояние дисбиоза, характерное для ЯК, в последние годы стало предметом значительного интереса и изучения [7–9]. Критические композиционные и функциональные изменения микробных сообществ, выявляемые у пациентов с ЯК, по сравнению со здоровыми людьми, а также идентификация мутаций в генах, участвующих во взаимодействиях микробиома и иммунной системы, выступают в поддержку фундаментальной роли микробиоты в механизмах развития и прогрессирования заболевания [9].

Нарушения микробиотического баланса – изменения в микробном составе, связанные с активностью ЯК, могут служить детерминантами ответа на лечение: исследования демонстрируют потенциал микробиома кишечника – его составляющих или метаболитов – в качестве диагностических биомаркеров для оценки активности заболевания или эффективности терапии [10, 11].

Цель исследования – изучение бактериального сообщества толстой кишки у пациентов с ЯК в различные фазы течения заболевания и у группы здоровых добровольцев, а также разработка на основании полученных данных модели, отражающей прогноз эффективности консервативной (базисной) терапии в достижении клинико-эндоскопической ремиссии ЯК.

Материал и методы

В исследование было включено 128 пациентов с ЯК с легкой и средне-тяжелой степенью активности заболевания: 86 пациентов в фазе рецидива ЯК (32,03 ± 5,5 года) и 42 пациента в фазе ремиссии (38,0 ± 4,4 года), 56 (20,5 ± 1,4 года) здоровых добровольцев составили группу контроля.

Всем больным, включенным в исследование, были проведены комплексное клинико-инструментальное и лабораторное обследования в соответствии с национальными клиническими рекомендациями по диагностике и лечению больных с ЯК [12].

Таксономический состав бактериальной микробиоты толстой кишки определяли с помощью исследования копрофильтрата методом NGS-секвенирования 16S рибосомальной РНК. У больных ЯК анализ выполняли в период рецидива заболевания и через 12 недель базисной терапии при достижении клинико-эндоскопической ремиссии.

Статистическую обработку данных выполняли в пакете прикладных программ SPSS версии 26 (IBM, USA). Проверку на нормальность распределения количественных данных проводили с помощью критериев Колмогорова – Смирнова (с коррекцией значимости Лильефорс) и Шапиро – Уилка. Гипотезы о соответствии распределения нормальному были отвергнуты, в связи с чем расчет описательных статистик представлен медианой и квартилями. Сравнение групп выполнено с помощью непараметрического критерия Манна – Уитни. Для сравнения показателей, подчинявшихся нормальному закону распределения, применяли t-критерий Стьюдента. Различия признавали статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты

Метагеномный анализ позволил выявить в составе бактериальной микробиоты кишечника у пациентов с ЯК 18 типов микроорганизмов, в том числе 282 рода и 273 вида. Анализ микробиоты в контрольной группе определил в образцах 21 тип микроорганизма и 432 рода. Представители типов Firmicutes, Bacteroidota, Proteobacteria и Actinobacteriota определялись в образцах всех обследуемых пациентов. Таксономический состав флоры на уровне типа представлен на рис. 1.

На уровне рода у всех участников из контрольной группы регистрировались Bacteroides, Unclassified и Parabacteroides. Alistipes, Blautia, Colidextribacter, Butyricicoccus обнаруживались у 95,24% обследуемых, остальные – в меньшем числе случаев. У 100% пациентов в группе рецидива обнаруживались роды Bacteroides, Unclassified и Streptococcus; у 90,9% – Faecalibacterium, Prevotella, Blautia, Pelomonas, Incertae Sedis. У всех пациентов группы ремиссии регистрировались 15 родов бактерий: Bacteroides, Unclassified, Faecalibacterium, Alistipes, Bifidobacterium, Lachnospira, Agathobacter, Lachnoclostridium, Blautia, Roseburia, Oscillibacter, Butyricicoccus, Romboutsia, Incertae Sedis и Intestinimonas. Представленность наиболее часто встречающихся родов микроорганизмов в группах отражена на рис. 2.

Для оценки состава микробного сообщества толстой кишки проводилось изучение представленности микроорганизмов в биологических образцах. Доминирующими филумами в образцах всех исследуемых групп были представители четырех типов: Firmicutes, Bacteroidota, Proteobacteria и Actinobacteriota. Основная часть микробиоты контрольной группы представлена родами: Bacteroides, Prevotella, Bifidobacterium и Alistipes. Ключевыми типовыми представителями в образцах пациентов с ЯК являлись Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Alistipes, Bifidobacterium и Subdoligranulum.

На основе данных о процентном соотношении выявленных родов бактерий в исследуемых образцах была построена модель логистической регрессии, позволяющая оценить эффективность консервативного лечения в достижении клинико-эндоскопической ремиссии ЯК. С учетом того факта, что между уровнями различных микроорганизмов наблюдалась корреляционная зависимость, в окончательную модель вошли только те таксоны, которые оказывали статистически значимое влияние, демонстрировали наибольшие абсолютные различия в содержании и не имели значимой взаимной корреляции. Оценочные показатели работы модели приведены в табл. 1.

Формула для данной модели:

где χ₁ – уровень Enterococcus; χ₂ – уровень Streptococcus; χ₃ – уровень NK4A214_group; χ₄ – уровень Pelomonas; χ₅ – уровень Actinomyces; e – основание натурального логарифма.

Если величина р составляет 39,29% и более, то прогнозируют эффективность консервативной терапии и достижение ремиссии у пациента с ЯК [13].

Результаты анализа показали, что предложенная модель является статистически значимой, согласно критерию хи-квадрат Пирсона (p = 0,002). Величины псевдо-коэффициентов детерминации свидетельствуют о высокой объясняющей способности модели: коэффициент Кокса и Снелла составил 0,556, а скорректированный показатель Нэйджелкерка достиг 0,741.

Оценка прогностической валидности модели продемонстрировала высокую дискриминативную способность: чувствительность – 0,833, специфичность – 1,0. Площадь под ROC-кривой (AUC-ROC) составила 0,909 (95%), что указывает на высокую дифференциацию между группами пациентов с ремиссией и рецидивом ЯК (рис. 3). Таким образом, разработанная модель обладает высокой прогностической точностью и может быть рекомендована для клинического применения.

Обсуждение

Основными доминирующими филумами в образцах пациентов с ЯК и в контрольной группе были представители четырех типов: Firmicutes, Bacteroidota, Proteobacteria и Actinobacteriota. Данные микроорганизмы являются типичными и основными представителями нормофлоры, занимая нишу в 98–99% от всего микробного сообщества толстой кишки. Различия в структуре флоры на уровне типа характеризовались повышением уровня филума Actinobacteriota и снижением уровня Verrucomicrobia у пациентов с ЯК как в стадии обострения, так и в стадии ремиссии заболевания при сравнении с группой контроля.

Таксономический ландшафт на уровне рода имел более выраженные композиционные отличия. Так, в группе контроля микробиотическое сообщество в своем большинстве представлено анаэробными короткоцепочечными жирными кислотами-продуцентами (КЦЖК-продуцентами), являющимися ключевыми представителями аутохтонной микробиоты в норме, – Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Bifidobacterium и Alistipes. Доминирующими бактериями на уровне рода в группах с ЯК были также «противовоспалительные» КЦЖК-продуцирующие бактерии, составляющие здоровый микробиоценоз толстой кишки: Bacteroides, Faecalibacterium, Prevotella, Alistipes, Bifidobacterium, Subdoligranulum. Однако роды Collinsella и Ruminococcus, обладающие при неблагоприятных условиях провоспалительным потенциалом, занимали ключевые позиции. В группе рецидива ЯК, по сравнению с группой ремиссии, обнаружен более высокий уровень условно-патогенных бактерий – родов Enterococcus, Streptococcus, Granulicatella, Pelomonas, Actinomyces. Кроме этого, отмечено повышение уровня Bifidobacterium – пробиотического рода бактерий, обладающего, однако, при высоких значениях неблагоприятными свойствами для слизистого барьера кишечника. В сравнении со здоровыми добровольцами у пациентов с ЯК отмечалось сниженное количество КЦЖК-продуцентов родов Alistipes, Akkermansia (в группе ремиссии), Phascolarctobacterium (в обеих группах с ЯК) и повышение уровня бактерий патогенных и условно-патогенных родов, в частности рода Dialister, в различные фазы течения ЯК.

Ключевыми стратегическими целями в лечении ЯК являются достижение и поддержание эндоскопической и гистологической ремиссии, что инструментально определяется инвазивными методами исследования [14]. Альтернативные диагностические маркеры: С-реактивный белок (СРБ), скорость оседания эритроцитов (СОЭ), антинейтрофильные цитоплазматические антитела (АНЦА), фекальный кальпротектин демонстрируют ограниченную специфичность и могут использоваться только в качестве дополнительных методов [15]. Микробиомные предикторы представляются новым и многообещающим инструментом для использования в клинической практике и оптимизации персонализированных стратегий лечения. Прогнозная модель, разработанная на основании результатов многофакторного анализа бактериальной микробиоты толстой кишки, представляет возможную перспективу в повышении точности и специфичности определения эффективности лечения и достижения клинической ремиссии заболевания.

Заключение

Рецидивирующее и ремиттирующее течение ЯК обуславливает потребность в оптимизации диагностики, терапии и предотвращении осложнений. Существующие на сегодняшний день стратегии мониторинга являются инвазивными и дорогостоящими. Характеристика ключевых микробных таксонов и их значение в патогенезе ЯК являются предметом активного изучения. Благодаря секвенированию микробиома разрабатываются новые диагностические, прогностические и терапевтические инструменты.

Анализ микробиологического ландшафта толстой кишки и разработка метода прогнозирования ремиссии в рамках проведенного исследования являются важным шагом в понимании микробных сигнатур, ассоциированных с ЯК, и создании точного и оптимального предиктора эффективности терапии.

Исследование проведено при поддержке гранта «Умник» Фонда содействия инновациям  (договор № 17315ГУ/2022 от 13.04.2022).