Сравнительная оценка полимеразной цепной реакции, гистологического и бактериологического методов в выявлении инфекции Helicobacter pylori и ее резистентности к кларитромицину

Результаты обнаружения инфекции H. pylori с помощью ПЦР и гистологического метода, % (95%-ный доверительный интервал (ДИ))

Введение

Распространенность инфекции Helicobacter pylori (H. pylori) в мире за последние три десятилетия снизилась на 15,9% во взрослой популяции и находится на уровне 43,9% [1, 2], в России распространенность Н. pylori в 2017 г. в среднем составила 41,8%, в 2019 г. – 36,4% [3]. Опубликованные данные свидетельствуют о значительном снижении распространенности этой инфекции в Москве и в России [4–6].

Бактерия H. pylori была признана этиологическим фактором ряда заболеваний желудка, таких как хронический гастрит, язвенная болезнь, MALT-лимфома (лимфома маргинальной зоны, мальтома) и аденокарцинома желудка. Кроме этого, были опубликованы исследования, указывающие на связь H. pylori и ряда состояний, таких как иммунная тромбоцитопения, В12-дефицитная анемия, аллергия и т.д. [7, 8]. Признание бактерии инфекционным агентом на Киотском консенсусе изменило подход к скринингу и лечению этой инфекции [7, 9]. На сегодня, согласно рекомендациям консенсуса Маастрихт VI, подход «тестируй и лечи» является приоритетным во многих странах и в России в частности [10]. Скрининг и лечение инфекции H. pylori признаны стратегией первичной профилактики рака желудка [11, 12].

Эффективность схем эрадикационной терапии снижается в связи с ростом резистентности H. pylori к ключевым антибиотикам: кларитромицину, метронидазолу и левофлоксацину [13]. В Москве резистентность к кларитромицину достигла уровня 24%, к левофлоксацину – 23% [14]. В России резистентность к кларитромицину превысила 21% [6].

Ввиду высокой распространенности инфекции и возрастающей резистентности H. pylori к антибактериальной терапии, критически важным является использование методов, обладающих высокой чувствительностью и специфичностью в определении бактерии [15].

Традиционным методом оценки чувствительности бактерии H. pylori к кларитромицину является бактериологический (культуральный) метод с антибио­тикограммой, однако недавно появились новые методы диагностики, такие как полимеразная цепная реакция (ПЦР) в реальном времени, позволяющие точно и быстро обнаруживать патоген [16, 17].

Рекомендации консенсуса Маастрихт VI указывают на важность внедрения молекулярных тестов, таких как ПЦР, для определения инфекции H. pylori и ее резистентности к антимикробным препаратам, в частности к кларитромицину [7]. Кроме того, пандемия COVID-19 сделала оборудование для проведения ПЦР более доступным во всем мире. Тем не менее, согласно данным Европейского регистра ведения H. pylori (Hp-EuReg), наблюдается большая гетерогенность в использовании тестов для первичной диагностики инфекции и подтверждения эрадикации [18].

Цель – сравнение диагностической точности ПЦР, гистологического и бактериологического методов в выявлении инфекции H. pylori в биоптатах из желудка и сопоставление данных ПЦР и бактериологического метода (антибиотикограммы) для выявления резистентности H. pylori к кларитромицину.

Материал и методы

В данное исследование были включены пациенты, проходившие диагностику и лечение инфекции H. рylori в Университетском клиническом центре г. Нант (Франция) в период с сентября 2021 г. по декабрь 2023 г. и Московском клиническом научно-практическом центре (МКНЦ) им. А.С. Логинова в период с 2022 по 2025 г. Во французской когорте было обследовано 100 пациентов, все они имели в анамнезе хотя бы одну неуспешную попытку эрадикации, в то время как пациенты российской когорты (n = 321) ранее от H. рylori не лечились. Пациенты не принимали антибактериальные препараты и препараты висмута как минимум за четыре недели до проведения исследования, а ингибиторы протонной помпы (ИПП) – за две недели.

Всем пациентам французской когорты для диагностики инфекции H. рylori проводили эзофагогастродуоденоскопию (ЭГДС) со множественными биопсиями (минимум восемь биопсий: четыре – для ПЦР и культурального исследования, четыре – для гистологии) с целью выявления инфекции H. рylori и определения чувствительности бактерии к кларитромицину. В Москве всем пациентам при ЭГДС было взято пять биоптатов из тела и антрального отдела желудка по новому Сиднейскому протоколу для морфологического исследования и один-два биоптата из антрального отдела желудка для выявления H. pylori методом ПЦР.

Представленное исследование было проведено согласно Хельсинкской декларации и утверждено локальным этическим комитетом. Добровольное согласие на участие в исследовании было подписано всеми его участниками.

ПЦР в реальном времени

Для молекулярного анализа был использован метод ПЦР в реальном времени – RIDA®GENE H. pylori RT-PCR для французской когорты и Real-time PCR kit Helicobacter pylori & resistance (ООО «ГастАРТ») для российской когорты. Тесты были выполнены согласно инструкциям производителей. Для определения резистентности к кларитромицину во французской и российской когортах были определены мутации в гене 23S rDNA 2142 и 2143.

Гистологическое исследование

Патоморфологическое исследование проводили на биоптатах, взятых при проведении ЭГДС из антрального отдела и тела желудка, фиксированных в 10%-ном нейтральном формалине. После того как препарат залили в парафиновую среду, обработали и окрасили гематоксилином и эозином согласно стандартным методикам, была проведена оценка выраженности гистологических признаков воспаления и атрофии с использованием международных систем Operative Link for Gastritis Assessment (OLGA) и Operative Link for Gastritis assessment/Intestinal Metaplasia (OLGIM).

Иммуногистохимическое исследование (ИГХ) было выполнено во французской когорте в случаях отсутствия H. pylori при использовании стандартной окраски в сочетании с хроническом гастритом, фокальным гастритом, сомнительных результатах или для контроля эрадикации спустя минимум четыре недели после окончания курса лечения H. pylori.

Бактериологический метод и антибиотикограмма

Чашки Петри с агаровой средой немедленно были помещены в микроаэрофильную атмосферу для инкубации при температуре 35 ± 2 °C. Мониторинг роста колоний осуществляли каждые 48 часов до 12 суток. В случае появления колоний, макроскопически имеющих сходство с H. pylori, проводили биохимические тесты и микроскопический анализ для подтверждения диагноза. Для дальнейшей оценки чувствительности к таким антибиотикам, как кларитромицин, амоксициллин, левофлоксацин и рифампицин, проводили инокуляцию чашек суспензией по стандарту McFarland; для окончательного диагноза критерии Европейского комитета по определению чувствительности к антимикробным препаратам (EUCAST) были соблюдены.

Статистический анализ данных

Для представления всех данных использовали методы описательной статистики. Чувствительность, специфичность, прогностическая ценность положительного и отрицательного результатов и их доверительный интервал, а также значение р ­были рассчитаны с помощью статистического программного обеспечения R.

Для определения чувствительности и специфичности ПЦР и гистологии в способности выявлять H. pylori золотым стандартом считали все случаи положительного результата ПЦР и/или гистологии. Для оценки чувствительности и специфичности ПЦР и антибиотикограммы в способности выявлять резистентность H. pylori к кларитромицину золотым стандартом считали положительные результаты ПЦР и/или антибиотикограммы.

Результаты

Пациенты 

В исследование был включен 421 пациент, среди которых 100 пациентов наблюдались в Университетском клиническом центре г. Нант (средний возраст – 49,9 года) и 321 пациент в МКНЦ им. А.С. Логинова (средний возраст – 50,7 года). 57% пациентов французской когорты были рождены в странах Африканского континента и восточной Европы и мигрировали во Францию, в то время как все пациенты МКНЦ им. А.С. Логинова родились и проживали на территории Российской Федерации.

Определение наличия инфекции H. pylori 

Методом гистологии инфекция была обнаружена у 237/421 (56,2%), в то время как ПЦР была положительной у 281/421 (66,7%) пациента (таблица).

Бактериологический метод был проведен всем 100 пациентам из французской когорты; распространенность инфекции по результатам посева составила 53/100 (53%), в то время как у этих же пациентов ПЦР выявила распространенность инфекции у 64/100 (64%), а гистология – у 66/100 (66%).

Определение резистентности к кларитромицину

При определении резистентности к кларитромицину во французской когорте cреди 45 пациентов, которым была выполнена антибиотикограмма и ПЦР на чувствительность к кларитромицину, в восьми случаях была обнаружена резистентность по данным антибиотикограммы и в девяти – по данным ПЦР. При этом ПЦР показала чувствительность и специфичность 100% в сравнении с золотым стандартом (ПЦР и/или антибиотикограмма). Чувствительность и специфичность культурального метода составили 90% (95%-ный доверительный интервал (ДИ) 55,50–99,75%) и 100% соответственно.

По данным ПЦР, резистентность H. pylori к кларитромицину была обнаружена в 12 случаях из 64 (18,8%). Антибиотикограмма была выполнена только в 45 из 53 H. pylori-положительных случаев, из-за некультивируемых образцов – в пяти случаях и технических проблемах – в трех случаях. Таким образом, резистентность к кларитромицину с помощью антибиотикограммы была выявлена у 8/45 (17,8%) пациентов, все из которых были также положительными по результатам ПЦР. Статистически значимой разницы между тестами в определении резистентности H. рylori к кларитромицину не обнаружено (p > 0,05).

У одного пациента с резистентностью к кларитромицину по результатам ПЦР и чувствительностью по результатам антибиотикограммы после проведения молекулярного анализа (в Национальном референсном центре по Хеликобактеру во Франции) была подтверждена двойная популяция H. pylori (гетерорезистентность).

Микроскопическая оценка биоптатов в случаях расхождения результатов тестирования 

В двух случаях, в которых гистология превосходила ПЦР в способности выявления H. pylori, микроскопическая картина соответствовала норме или антральному гастриту у пациентов из французской когорты. У всех 11 таких пациентов российской когорты обнаружена умеренная/тяжелая атрофия по OLGA.

В случаях, когда ПЦР превосходила бактериологический метод, микроскопическая картина соответствовала атрофии средней степени и кишечной метаплазии в области дна желудка у первого пациента; хроническому атрофическому пангастриту с тяжелой степенью атрофии (OLGA 4, OLGIM 4) –  у второго и подозрению на MALT-лимфому – у третьего. Во всех указанных трех случаях ПЦР и гистология были положительными, а при посеве не выявлено роста колонии H. pylori.

Наконец, при обнаружении H. pylori методом ПЦР, когда гистологический метод давал отрицательный результат (57/421), у всех пациентов имела место атрофия слизистой: преимущественное большинство пациентов, 27/57 (47,3%), имели атрофию тяжелой степени, 22/57 (38,5%) – атрофию средней степени и 8/57 (14%) – атрофию легкой степени.

Обсуждение

На сегодня в клинической практике доступен широкий спектр инвазивных и неинвазивных методов диагностики инфекции H. рylori. Согласно анализу данных Европейского регистра ведения H. рylori, для первичной диагностики инвазивные тесты применяли в 71% случаев, неинвазивные – в 41% и оба вместе – в 12% случаев. Наиболее часто применяли гистологический тест (43%), быстрый уреазный тест (38%) и ¹³С-уреазный дыхательный тест (27%). Пациенты, которым было проведено инвазивное тестирование, в 60–99% случаев были старше 50 лет. Для контроля эрадикации использовали неинвазивные методики в 93% случаев и только в 5% случаев для этой цели был использован гистологический метод [18].

Преимуществом инвазивных методов является не только прямая оценка наличия бактерии посредством микроскопического исследования био­птатов, но также патоморфологическая оценка слизистой желудка, что особенно актуально для симптоматических пациентов старше 50 лет или пациентов с положительным семейным онкологическим анамнезом (средний возраст пациентов в нашем исследовании около 50 лет).

Согласно результатам представленного исследования, чувствительность гистологического метода составила 83%, специфичность – 92%, что соответствует ранее опубликованным данным [19]. Однако следует учитывать и недостатки метода, зависящие от ряда факторов, таких как опыт морфолога, плотность и неравномерность бактериальной обсемененности, прием пациентом препаратов висмута и/или ИПП и наличие атрофических изменений слизистой желудка [15]. Действительно, в нашей работе показано, что недостатком гистологического метода может являться ложноотрицательный результат в условиях умеренной/тяжелой атрофии. J.H. Kim и соавт. в исследовании биоптатов сероположительных пациентов показали, что наличие аденокарциномы/аденомы желудка и низкий уровень пепсиногена II были независимыми предикторами ложноотрицательного результата гистологического исследования при окраске по Гимзе, и предложили взятие дополнительных биопсий для повышения чувствительности метода [20]. Некоторыми экспертами было рекомендовано добавлять к протоколу оценку интенсивности нейтрофильной инфильтрации, особенно у пациентов, принимающих ИПП. Кроме этого, существует проблема ложноположительного результата, когда другие микроорганизмы ошибочно принимаются за H. рylori. Иммуногистохимический анализ в таких случаях помогает разрешить дилемму, однако это значительно повышает стоимость диагностики [21].

Бактериологический метод является ценным благодаря возможности проведения антибиотикограммы в случае роста бактерии, однако такие ограничения, как длительное время культивирования, особые условия транспортировки, низкий процент выделения культуры (до 60%), ограничивают применение метода [15]. В нашем исследовании бактериологический метод показал наиболее низкую способность к выявлению патогена в сравнении с ПЦР и гистологией. Кроме этого, в восьми H. pylori-положительных культурах выполнение антибиотикограммы не удалось провести ввиду технических причин, что значительно снизило ценность метода.

На сегодня ПЦР по всем характеристикам может быть референсным методом. В нашем исследовании чувствительность ПЦР составила 95%, специфичность – 90% при сравнении с результатами ПЦР и/или гистологии в качестве эталона. Наши результаты подтверждают ранее опубликованные данные [22], что доказывает целесообразность применения ПЦР в качестве метода контроля как в сомнительных ситуациях, так и в рутинной клинической практике ввиду быстроты и легкости применения, ценности в особых клинических условиях. Недавний обзор литературы предлагает комбинацию методик выявления инфекции H. pylori для повышения диагностической точности [15].

Ценной находкой в нашем исследовании было обнаружение у одного пациента одновременно двух штаммов H. pylori. Резистентность может быть гомогенным свойством в пределах одной популяции бактерий, однако отдельные бактерии также могут обладать разной чувствительностью к антибактериальному препарату, что известно как гетерорезистентность, в основном с фенотипической точки зрения. Инфекция, гоморезистентная к кларитромицину, содержит только устойчивые бактерии, в то время как гетерорезистентность может проявляться либо как сосуществование чувствительных и резистентных к кларитромицину бактерий в одной нише (внутринишевая гетерорезистентность), либо как отдельные субпопуляции с различными свойствами резистентности в нескольких локациях, что известно как межнишевая гетерорезистентность [23]. Три профиля резистентности (моно-, множественная и гетерорезистентность), по-видимому, имеют общие механизмы развития и схожие клинические последствия [24]. В исследовании K. Kotilea и соавт. гетерорезистентность к кларитромицину была обнаружена дисковым методом с применением Е-теста у 2% пациентов педиатрической популяции, ранее не получавших терапию [25]. В недавнем исследовании на 305 пациентах с инфекцией H. pylori методом флуоресцентной гибридизации in situ (FISH) гетерорезистентность была обнаружена примерно в половине случаев. Интересной находкой была склонность к гоморезистентности у пациентов с предшествующей попыткой эрадикации [23]. Несмотря на такие значимые расхождения в частоте гетерорезистентности между исследованиями, результаты метаанализа, включившего 22 исследования 3852 пациентов с инфекцией H. pylori, подтверждают гетерорезистентность к кларитромицину – в 7% случаев и к метронидазолу – в 14% [26], поэтому клиницисты должны быть осведомлены о возможном наличии двойной популяции H. pylori у пациента.

Таким образом, в представленном исследовании были показаны преимущества ПЦР как в качестве метода диагностики H. pylori, так и для выявления резистентности к кларитромицину. Метод ПЦР продемонстрировал чувствительность при низкой бактериальной обсемененности, меньшую зависимость от оператора и высокую скорость выполнения.  

Конфликт интересов.

Статья содержит материал, ранее опубликованный авторами [27].