Органы без скальпеля

Когда мы говорим, что трава зеленая, это означает, что лист отражает световые волны зеленой области спектра, а все остальные поглощает. Если выделить основной пигмент зеленого листа, хлорофилл, и в темной комнате посветить на него синим светодиодным фонариком, хлорофилл ответит непродолжительной вспышкой насыщенного рубинового цвета — флуоресценцией. В арсенале растений есть и другие светочувствительные молекулы, называемые фитохромами – от греческих слов phyton (растение) и chroma (цвет, краска). Основное их предназначение – регулировать циркадные ритмы, цветение, прорастание семян. Обнаружены фитохромы и у некоторых фотосинтетических бактерий. О том, какую пользу это явление может принести биомедицине, «Газете.Ru» рассказал руководитель исследования Владислав Верхуша. 

Результатом исследований в данном направлении стали три недавние научные публикации: в Nature Methods, Chemistry & Biology и Nature Communications. 

Растения, в отличие от бактерий, в качестве светопоглощающей основы фитохрома – хромофора – используют такие производные гема, которые полностью отсутствуют у млекопитающих. А вот у некоторых бактерий (и это просто удивительное совпадение!) в состав их фитохромов входит предшественник билирубина млекопитающих – биливердин. И это означает, что бактериальные фитохромы сохранят часть своих функций, если ввести их животным или даже человеку. 

Да, биливердин – это промежуточный продукт на пути превращения гемоглобина в компонент желчи, билирубин. 

А каков практический эффект от применения именно ваших белковых конструкций? Ведь не вы первые: работы в этом направлении ведут во многих лабораториях. Есть, например, «зелёный флуоресцирующий белок» и другие. 

Чтобы получить изображения живых тканей и органов млекопитающих, включая человека, с использованием флуоресцентных маркеров, наблюдения лучше всего проводить в ближне-инфракрасном «окне прозрачности» тканей (650–900 нм). В этой области спектра поглощение света естественными хромофорами (гемоглобином эритроцитов и черным пигментом меланином, присутствующим в клетках эпидермиса кожи, печени и других органов и тканей) пренебрежимо мало, молекулы воды в этой области тоже не поглощают. Флуоресцентные белки из широко используемого семейства зелёного флуоресцентного белка плохо пригодны для таких целей, так как флуоресцируют за пределами ближне-инфракрасного «окна». На настоящий момент только полученные в нашей лаборатории методами молекулярной инженерии из бактериальных фитохромов флуоресцентные белки способны подавать световой сигнал из таких глубин органов и тканей, где другие маркеры глушатся гемоглобином и меланином. Эти белки помогают рассмотреть процессы, происходящие в живом организме на глубине до 20 мм. 

Да, если лабораторной мыши пересадить клетки опухоли молочной железы, в которых синтезируется один из наших белков, то уже через неделю с его помощью мы получим информацию о росте этой опухоли, а другой белок одновременно может сообщать, скажем, о функциональном состоянии печени. Сделать такое свечение видимым можно, подсвечивая ткани светом определенной длины волны. Справа на рисунке вы видите, как можно визуализировать свечение с помощью неинвазивной (без повреждения тканей) флуоресцентной томографии. Раковая опухоль, в которой синтезируется один ближне-инфракрасный флуоресцентный белок, здесь помечена условным зелёным цветом, а печень, «окрашенная» другим белком, – красным. 

Не совсем так. Мы создали три различных типа новых генетически кодируемых ближне-инфракрасных флуоресцентных маркеров – методами мутагенеза заменили некоторые аминокислоты в молекулах бактериальных фитохромов. В результате первый тип белков, о которых шла речь выше, сохранил лишь одну из способностей природного фитохрома – «чувствовать» свет в ближне-инфракрасной области спектра. При освещении светом соответствующей длины волны такие белки флуоресцируют постоянно. 

Сходными свойствами обладает и зонд, состоящий из двух «половинок», которые могут собираться воедино при определенных условиях и только после этого флуоресцировать. Такой собирающийся «репортёр» можно использовать для детекции белок-белковых взаимодействий глубоко в организме. В модельном примере, который продемонстрирован в нашей статье, зонд собирался и в пробирке, и в живой ткани. 

Наконец, в третьем типе маркеров мы сохранили способность природных фитохромов совершать структурный переход в ответ на дальне-красный свет. Исходно эти белки практически не флуоресцируют. Для «включения» флуоресценции их нужно лишь кратковременно облучить импульсом света, то есть фотоактивировать. И только после этого они начнут «светиться». Кстати, без фотоактивируемых белков была бы невозможна современная микроскопия сверхвысокого разрешения, когда оптическими методами вы получаете изображения клеток с пространственным разрешением в десять раз выше, чем достижимые на современном конфокальном микроскопе. 

В целом все три типа ближне-инфракрасных маркеров позволят увидеть многие биологические процессы, происходящие глубоко в тканях живых организмов. С их помощью можно будет проводить многоцветовое мечение клеток и целых органов, следить за динамикой отдельных групп клеток и даже наблюдать, как происходят белковые взаимодействия в организмах млекопитающих.