Микробиота кишечника и метаболом у больных, получающих перитонеальный диализ

Таблица 1. Клинические данные пациентов

Рис. 1 . Относительная средняя численность бактерий в образцах на уровне: А – филума, Б – класса, В – ордера, Г – семейства

Таблица 2. Динамика биохимических показателей у больных до и после лечения Нормофлорином-Д

Таблица 3. Динамика метаболома у пациентов на ПАПД после курса Нормофлорина-Д

Рис. 2. Статистически значимые изменения метаболитов после лечения Нормофлорином-Д

Введение

По данным зарубежных популяционных регистров и исследований, распространенность хронической болезни почек (ХБП) среди населения составляет 10–13%, достигая 20% в группах высокого риска, что сопровождается широким спектром социально значимых заболеваний. В последние годы исследование микробиома человека, в частности микробиоты кишечника, представляет большой интерес для ученых коллективов по всему миру. ХБП тесно связана с дисбалансом микробиома человека не только из-за своих специфических проявлений, таких как уремия, хроническое воспаление, иммуносупрессия, но и в связи с фармакологической нагрузкой и диетическими ограничениями. Группа больных с терминальной стадией ХБП, получающая заместительную почечную терапию методом постоянного амбулаторного перитонеального диализа (ПАПД), представляет большой интерес в изучении изменений микробиома в связи с дополнительными факторами воздействия на организм, связанными с особенностью методики. Нахождение в брюшной полости диализирующего раствора с глюкозой и перитонеального катетера – немаловажные факторы, влияющие на микробиом человека.

Измененная микробиота играет важную роль в продукции, циркуляции и накоплении разнообразных уремических токсинов, ответственных за возникновение типичных осложнений ХБП (прогрессирование сердечно-сосудистых заболеваний, сосудистая кальцификация, инфекции, диализный перитонит и т.д.) [1].

Уремические токсины представляют собой гетерогенную группу веществ, различающихся по своему происхождению и молекулярной массе, связи с белками-переносчиками оказывают патологический эффект на организм человека: их насчитывается более 200 и список продолжает пополняться. В настоящее время многочисленные исследования указывают на непосредственное участие кишечной микробиоты в метаболизме уремических токсинов (например, индоксилсульфат, п-крезол, амины, аммиак, триметиламиноксид (ТМАО) и многие другие) [2–4].

Среди факторов, способствующих образованию и повышению проникновения токсических метаболитов, выделяют непропорциональное соотношение потребляемых белков и углеводов, в частности клетчатки, изменение pH кишечника, увеличение времени пассажа по толстой кишке, увеличение проницаемости кишечной стенки.

Продолжаются исследования потенциальных методов воздействия на кишечную микробиоту с целью снижения уровня бактериальных уремических токсинов. Среди перспективных методов можно выделить: вмешательства, модулирующие рост кишечных бактерий (например, пробиотики, пребиотики, диетическая модификация); адсорбенты, связывающие бактериальные уремические токсины в просвете кишечника; трансплантация фекальной микробиоты [2].

Эффективность и клиническая польза этих стратегий в настоящее время являются активной областью интереса нефрологов.

Цель исследования – изучить особенности микробиоты кишечника у больных группы перитонеального диализа и оценить влияние пробиотических препаратов на основные биохимические показатели и метаболомный профиль в исследуемой группе.

Материал и методы

В исследование были включены 60 пациентов с ХБП стадии 5Д (ХБП 5Д), находившихся на лечении ПАПД в нефрологическом центре Московского многопрофильного научно-клинического центра им. С.П. Бот­кина. Основным заболеванием у 42 из них был хронический гломерулонефрит, у 10 – хронический тубулоинтерстициальный нефрит, у шести – диабетическая болезнь почек и у двух – поликистозная болезнь почек взрослых. Из исследования были исключены пациенты, перенесшие лечение антибиотиками, пробиотиками/пребиотиками и слабительными в течение последних 12 недель, предшествовавших сбору образцов, а также пациенты с острым перитонитом и те, кто перенес его менее чем за три месяца до начала исследования. Целью исследования было изучение особенностей микробиоты кишечника пациентов, находящихся на перитонеальном диализе, и влияния лечения пробиотическим препаратом Нормофлорин-Д в течение одного месяца на метаболический профиль крови пациентов с ХБП. Участники были разделены на две группы: группа контроля (n = 20) и исследуемая группа, в который каждый пациент получал Нормофлорин-Д в течение одного месяца (n = 38).

Все пациенты получали препараты железа, вводимые парентерально, антигипертензивные и фосфатсвязывающие препараты. 42 пациента получали препараты соединений кальция и витамин D. В подгруппах пациентов значительных различий по полу, возрасту, индексу массы тела (ИМТ) не было (табл. 1).

Образцы венозной крови собирали утром натощак и центрифугировали со скоростью 3000 об/мин при 4 °C в течение 10 минут. Полученные супернатанты немедленно замораживали при температуре -80 °C. Метаболомное профилирование сыворотки крови проводили с использованием спектроскопии ядерного магнитного резонанса методикой (ЯМР) всем пациентам в двух точках, до и после приема пробиотика. Для ЯМР-анализа использовали 600 мкл сыворотки крови. Экстракцию полярных метаболитов проводили в соответствии с рекомендациями [5]. Для этого к образцу добавляли 600 мкл охлажденного (-20 °С) метанола и 600 мкл охлажденного (-20 °С) хлороформа. После интенсивного перемешивания в течение 30 минут при 5 °C образцы выдерживали 30 минут при -20 °C, затем центрифугировали в течение 30 минут (14000 g, 5 °C). Верхний водно-метанольный слой, содержащий полярные метаболиты, переносили в новую пробирку и высушивали с помощью вакуумного концентратора (SpeedVac Eppendorf Concentrator Plus) при комнатной температуре в течение 14 часов до полного испарения растворителей. До проведения измерений образцы хранили при температуре -60 °C. Высушенные экстракты растворяли в 600 мкл буфера для ЯМР. Для приготовления буферного раствора (20 мМ фосфат натрия при pH 7,0; 100 мкМ DSS-d6; 2 мМ азида натрия) смешивали сухие навески, растворяли в минимальном объеме D2O, лиофилизировали, а затем повторно растворяли в D2O (99,9%, Solvex).

Образцы переносили в стандартные пробирки (5 мл) для измерения ЯМР-спектров. Измерения проводили на ЯМР-спектрометре Bruker Avance 700 МГц (Bruker BioSpin, Ettlingen, Германия), оснащенном криодатчиком HCN Prodigy с градиентом по оси Z диаметром 5 мм, с использованием термостатируемого автосемплера (температура хранения 5 °C). Измерения спектров проводили при 25 °C. Одномерные спектры ЯМР 1Н были получены для каждого образца с использованием импульсной последовательности noesypr1d (1D NOESY-presat) со следующими параметрами: 131 072 точки данных, четыре пустых сканирования, 400 сканирований, ширина спектра – 19,8364 миллионных долей, время накопления – 4,7 секунды, релаксационная задержка между сканированиями – 3,0 секунды. Идентификацию метаболитов проводили с использованием программы Chenomx NMR Suite, а также с помощью базы данных Human Metabolome Database [6]. Концентрации метаболитов определяли по отношению к площади пика DSS с помощью функции интегрирования в программе Mestrenova.

У всех пациентов, включенных в исследование, были отобраны образцы стула в утреннее время в стерильной посуде. Образцы биоматериала по 500–700 мкг впоследствии заморожены при температуре -80 °С в пробирках «эппендорф» со стабилизирующим раствором этилендиаминтетрауксусной кислоты. Выделение ДНК проводили с использованием механической гомогенизации клеток при помощи керамических микрочастиц с использованием набора HiPure Stool DNA Kit (Magen Biotechnology, Китай), в соответствии с инструкциями производителя. Количественное определение выделенной ДНК проводили с помощью флуорометра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Библиотеки ампликонов для гипервариабельной области V4 гена 16S рРНК были подготовлены с использованием двухэтапной стратегии полимеразной цепной реакции (ПЦР). Каждый образец выделенной ДНК из окружающей среды и два отрицательных контроля ПЦР проводили в двух ПЦР-репликах по описанной методике [7].   

Амплификацию проводили на термоциклере Veriti (Applied Biosystems, США). Условия амплификации: начальная денатурация –120 секунд при 95 °С, затем 25 циклов; денатурация 95 °С – 20 секунд, отжиг праймера 59 °С – 20 секунд, элонгация 72 °С – 30 секунд; 72 °С – 5 минут, затем 4 °C до восстановления образца [7]. Полученные библиотеки объединяли эквимолярно. Конечный пул очищали с помощью набора QIAquick PCR Extraction Kit (Qiagen, Германия) в соответствии с протоколами производителя. Количественное определение полученных после очистки библиотек образцов проводили с помощью флуорометра Qubit 4.0 (Thermo Fisher Scientific, США). Концентрация итогового пула составляла 22,8 нг/мкл.

Секвенирование выполняли на системе MiSeq (Illumina, США) при помощи реагентов, которые позволяют прочитать 150 нуклеотидов с каждого конца фрагмента. Минимальная глубина секвенирования каждого образца составила 10 000 прочтений. Отрицательные контроли (образец, содержащий лабораторную воду, а также отрицательный контроль ПЦР) также были секвенированы для исключения ложноположительных результатов.

После секвенирования полученные данные подвергли тщательной предобработке: с использованием программы Cutadapt были обрезаны праймеры, соответствующие 16S рРНК [8], определены парные риды для одинакового соотношения forward и revers прочтений с помощью программы fastq_pair [9] и проведено демультиплексирование – сортировка ридов по файлам, соответствующим образцам, с помощью программы deML [10].

Для дальнейшего анализа 16S рРНК секвенирования использовали язык программирования R. С помощью библиотеки The Divisive Amplicon Denoising Algorithm 2 [11] были определены последовательности, относящиеся к одному организму, и их таксономическое положение на основе выравнивания к последней версии базы данных Silva99 [12]. В библиотеке Phyloseq [13] была создана база данных организмов, присутствующих в пробе, c указанием их количества и характеристиками каждого из образцов. Анализ был проведен с помощью библиотек Pheatmap, Vegan, Microeco и др. [14–16].

Для измерения креатинина мы использовали кинетический колориметрический метод; для измерения биохимических показателей крови использовали стандартные клинические ферментативные методы.

Все пациенты с ХБП 5Д более трех месяцев находились на ПАПД, и все пациенты подписали информированное согласие. Образцы собирали в период с 1 июня 2023 г. по 31 марта 2024 г. 

С помощью статистического программного обеспечения spss22.0 был проанализирован стандартный биохимический профиль всех пациентов. Данные измерений с нормальным распределением были выражены как среднее значение ± стандартное отклонение, а данные измерений с ненормальным распределением были описаны медианой (M) и квартилью (P25, P75); для сравнения использовали непараметрический тест. Парный t-тест (нормальное распределение) или знаковый ранговый тест Вилкоксона (ненормальное распределение) использовали для сравнения биохимических показателей до и после лечения Нормофлорином-Д; p < 0,05 считали статистически значимым.

Результаты

На рис. 1 показаны микроорганизмы на уровне филума, класса, ордера и семейства у пациентов, получающих ПАПД. Наглядно показано, что в среднем преобладающим филумом в образцах был Bacillota (синоним – Firmicutes), а вторым по величине филумом был Bacterioidota. Также наблюдалось присутствие Actinomycetota и Proteobacteria в значительных количествах. Значимыми на уровне класса были Bacterioidia филума Bacterioidota и Clostridia и Bacilli филума Bacillota. К филуму Actinomycetota относились классы Coriobacteriia и Actinobacteria. Протеобактерии были представлены в основном гамма-протеобактериями.

Получена разнонаправленная лабораторная динамика с положительными изменениями некоторых биохимических показателей. Некоторые лабораторные параметры представлены в табл. 2.

Как видно из табл. 2, уровни острофазовых плазменных биомаркеров, таких как С-реактивный белок (СРБ) и ферритин, снизились на 31,3% (p ≤ 0,05) и 13,2% (р ≤ 0,05) соответственно. Достоверно на 9,8% (р < 0,05) снизился уровень мочевой кислоты. Отмечалась положительная тенденция к снижению паратгормона и фосфора, но показатели не достигли статистически значимых значений.

У пациентов основной и контрольных групп было проведено исследование метаболомного профиля сыворотки крови. Исследуемыми веществами были аминокислоты, некоторые из уремических токсинов, глицерофосфолипиды и метаболиты цикла трикарбоновых кислот. Наиболее значимые изменения в концентрациях некоторых из них до и после лечения представлены в табл. 3.

По данным, представленным в табл. 3, достоверно повысились уровни метаболитов, таких как саркозин и орнитин, на 63,3% (p < 0,001) и 79,1 % (р = 0,002) соответственно. Отмечается тенденция к увеличению гиппурата на 39,3% (р = 0,57) и инозина на 14,7% (р = 0,4).

Всего в образцах сыворотки пациентов с ХБП было исследовано 58 метаболитов. Статистически значимые изменения после лечения Нормофлорином-Д были выявлены в метаболитах саркозин, фумарат, гипоксантин, метионин, изобутират, орнитин, ацетилхолин и пируват (рис. 2).

Полученные данные свидетельствуют о том, что терапия Нормофлорином-Д вызывает специфические метаболические изменения у пациентов с ХБП, в основном затрагивая метаболизм аминокислот и, в меньшей степени, метаболизм глицерофосфолипидов и цикл трикарбоновых кислот. У пациентов был отмечен положительный клинический эффект в виде улучшения настроения, уменьшения слабости, нормализации перистальтики кишечника. Побочных и нежелательных эффектов во время приема препарата не было отмечено ни у одного пациента.

Обсуждение

Представленные данные отражают результаты работы по оценке влияния пробиотиков на микробиом путем изучения микробиоты кишечника и динамики метаболома крови и биохимических показателей.

Выявленная динамика метаболитов, произошедшая на фоне лечения пробиотическим препаратом, интересна и требует дальнейшего изучения. Изменение концентраций некоторых метаболитов, таких как орнитин, оказывает гипоаммониемическое действие, утилизирует аммонийные группы в синтезе мочевины (орнитиновый цикл), что, в свою очередь, снижает концентрацию аммиака в плазме крови и способствует нормализации кислотно-щелочного состава организма, улучшает белковый обмен при ХБП. Повышение уровня саркозина в крови может служить биомаркером продолжительности жизни у млекопитающих, отражающим возрастные изменения метаболизма [17]. Обнаружено положительное влияние Нормофлорина-Д на данные биохимических параметров крови, выявлена тенденция к снижению креатинина, мочевины и мочевой кислоты, также отмечено достоверное снижение маркеров воспаления (СРБ, ферритин).

Заключение

На фоне лечения пробиотиком «Нормофлорин-Д» наблюдалось снижение уровней маркеров эндогенной интоксикации, что может косвенно указывать на благоприятное изменение состава микробиоты кишечника. Эти результаты дают надежду на то, что в перспективе появится возможность модулирования микробиоты, что, в свою очередь, позволит замедлить прогрессирование заболевания и улучшить исходы у больных с ХБП.

Исследование проведено в рамках гранта правительства Москвы № 1803-7/23.