Генетические исследования крови и ротовой жидкости у женщин с BRCA-мутацией, больных раком молочной железы, и их родственников

Введение

В процессе разработки индивидуального профиля риска развития рака молочной железы (РМЖ) в семьях с сильными паттернами РМЖ были идентифицированы два гена восприимчивости к этому заболеванию – BRCA1 и BRCA2. Эти гены кодируют белки-супрессоры опухоли, мутации которых индуцируют от 25 до 50% случаев наследственного РМЖ и могут быть обнаружены как у женщин, так и у мужчин [1–3]. Последние десятилетия изучение генетических аспектов злокачественных новообразований молочной железы в большей части было направлено на анализ ВRСА1/2-мутаций. Гены-супрессоры опухолей BRCA1/2 являются двумя основными генами предрасположенности к РМЖ и раку яичников. И было показано, что мутации в этих генах вносят вклад в патогенез рака груди и яичников. Хорошо известно, что значительная часть случаев наследственного РМЖ вызвана дефектами генов высокой пенетрантности BRCA1 [4], BRCA2 и TP53 [5]. Несколько генов промежуточной пенетрантности (CHEK2, ATM, PALB2 и RAD50) ответственны примерно за 5% случаев РМЖ [6–8].

Современным трендом в диагностике РМЖ является разработка неинвазивных и малоинвазивных методик. В настоящее время самая инновационная диагностическая методика в медицинской онкологии – это жидкостная биопсия [9]. Она способна преодолеть ограничения биопсии тканей. Компоненты биоматериала жидкостной биопсии представляют собой белки; пептиды; метаболиты; гормоны; антитела; цитокины и аминокислоты, содержащиеся в биожидкостях; циркулирующие опухолевые клетки; внеклеточные циркулирующие опухолевые нуклеиновые кислоты, располагающиеся в экзосомах, микровезикулах и тромбоцитах. Исследования выполняются на различных биологических жидкостях, извлеченных неинвазивным способом. Белки и нуклеиновые кислоты, связанные с раковыми клетками, были обнаружены в плазме и сыворотке крови, бронхоальвеолярной, спинномозговой [10] и других жидкостях тела человека. Эти нуклеиновые кислоты и белки используются в качестве молекулярных маркеров для ранней диагностики онкологических заболеваний [11], маркеров рецидивирования [12–14 ], метастазирования, выживаемости и прогноза заболевания [15, 16]. Возникновение злокачественных новообразований в молодом возрасте позволяет предполагать наличие генетической предрасположенности к РМЖ у пациенток данной группы. При имеющейся предрасположенности риск его развития существенно выше при наличии отягощенного семейного анамнеза, а максимальный риск отмечен для носителей значимых терминальных мутаций [17]. Приблизительно в 5% случаев РМЖ возникает на фоне носительства терминальных мутаций генов BRCA1/2. На долю мутаций в гене BRCA1 приходится 84%, в гене BRCA2 – только 0,5%.

Клинико-лабораторное исследование генетических маркеров у пациентов с наследственными формами рака имеет большое значение в диагностике и выборе оптимального лекарственного лечения. Итогом проведения таких исследований должна становиться разработка для пациента и членов его семьи индивидуальных рекомендаций по профилактике, ранней диагностике и лечению различных категорий наследственного РМЖ.

Цель исследования – определить диагностические критерии венозной крови и ротовой жидкости у пациенток с BRCA-ассоциированным РМЖ.

Материал и методы

В исследование включены две группы обследуемых. Первая группа – 30 женщин с диагностированным BRCA-ассоциированным РМЖ от 35 до 60 лет. Средний возраст составил 43,2 ± 0,7 года. Вторая группа – 15 женщин, ближайших родственниц больных BRCA-ассоциированным РМЖ. Возраст обследуемых в этой группе был от 18 до 75 лет. Средний возраст составил 31,6 ± 0,9 года. Всем обследуемым женщинам проведено исследование крови и слюны.

Взятие, предобработку и хранение биологического материала для исследований генетических полиморфизмов, ассоциированных с риском развития онкопатологии, проводили в соответствии с инструкцией к комплекту для выделения ДНК. Цельную венозную периферическую кровь, полученную путем венепункции, собирали в пластиковые пробирки объемом 4,0 мл, содержащие в качестве антикоагулянта ЭДТА. Образцы хранили до проведения исследования не более 2–4 часов при температуре от 2 до 8 ^°С.

Сбор образцов ротовой жидкости (слюны) производили сами обследуемые пациенты в предоставленный стерильный пластиковый контейнер с завинчивающейся крышкой. За два часа до сбора слюны исследуемые пациенты не принимали никакой пищи или напитков (за исключением чистой воды).

Непосредственно перед сбором слюны пациентам было необходимо выпить небольшое количество воды (до 200 мл). За пять минут до сбора ротовой жидкости участники прополаскивали рот водой. Затем нестимулированную слюну собирали пассивным слюноотделением в отсутствие жевательных движений в стерильные пластиковые контейнеры на 10 мл.

Сбор образцов проводился утром с 9 до 11 часов, чтобы свести к минимуму влияние циркадного ритма на секрецию, и длился от 10 до 15 минут. Процедура проводилась в комнате, где исследуемые находились в сидячем положении, слегка наклонив голову вниз, с минимальными движениями лица и губ в расслабленном положении на протяжении всей процедуры, чтобы избежать стресса. От каждого участника было получено от 3 до 6 мл ротовой жидкости. Чтобы образец соответствовал критериям исследования, он не должен был иметь признаков присутствия крови. В этой связи все образцы были проверены путем визуального осмотра, и в исследование не были включены те, где обнаружились признаки, указывающие на их загрязнение кровью. Сразу после сбора образцы ротовой жидкости (слюну) центрифугировали (скорость 8 000 оборотов в минуту, время – 15 минут) для удаления нежелательных частиц (например, клеток), затем супернатант собирали и разделяли на аликвоты, удаляя осадок. 

Применяли набор реагентов «ОнкоГенетика», использующих эффект флуоресценции, производства ООО «НПО ДНК-Технология» (Россия) для выделения ДНК из периферической крови и ротовой жидкости (слюны) для выявления наследственных мутаций 185delAG, 2080delA, 4153delA, 5382insC, c.3700_3704delGTAAA, c.3756_3759delGTCT, T300G в гене человека BRCA1 и 6174delT в BRCA2 методом ПЦР. Подготовку к ПЦР проводили с использованием ПЦР-боксов. Набор реагентов «ОнкоГенетика» включает смеси для амплификации, специфичные для каждого генетического полиморфизма, и положительные контрольные образцы.

Результаты и их обсуждение

Пригодность слюны в качестве альтернативного источника геномной ДНК для идентификации зародышевых мутаций в генах BRCA1/2 с помощью секвенирования следующего поколения не вызывает сомнений. У обследованных лиц с семейным анамнезом заболевания, но без клинических признаков РМЖ, по результатам скринингового исследования слюны выявлены ассоциированные с опухолью мутации в генах BRCA, что может предоставить информацию для раннего выявления, оценки молекулярной гетерогенности заболевания и его прогноза. Сочетание параллельных исследований слюны и крови может стать основой разработки эффективных тактик скрининговых и ранних диагностических исследований с использованием неинвазивных методов.

В первой группе обследуемых у больных с ВRСA-ассоциированным РМЖ результаты ПЦР-диагностики на наличие указанных мутаций в венозной крови и ротовой жидкости (слюны) совпали в 100% случаев. Во второй группе обследованных родственников больных (женщины первой линии родства – дочери пациенток) была подтверждена мутация методом ПЦР крови. При проведении исследования слюны также была выявлена мутация BRCA1 у 15 из 15 обследуемых этой группы. ВRСA2 мутаций среди обследуемых (в первой и второй группах) выявлено не было.

Генетическое тестирование для подтверждения наличия наследственных мутаций в этих генах поможет пациентам принять надлежащие профилактические меры, что приведет к меньшему количеству смертей от рака. Использование слюны в генетическом тестировании реально из-за ее лучшей транспортной стабильности по сравнению со стабильностью крови. Сравнительные исследования, проведенные нами на образцах слюны и крови от доноров, говорят о 100% совпадении результатов генотипирования однонуклеотидных полиморфизмов. Идентификация патогенных мутаций зародышевой линии является широко распространенным инструментом для прогнозирования риска развития наследственного рака.

Еще одно важное преимущество, связанное со слюной как источником геномной ДНК, – ее стабильность при хранении и транспортировке. Кровь необходимо хранить в холодильнике перед обработкой для извлечения ДНК, а условия хранения и транспортировки могут отрицательно повлиять на выход и общее качество экстрагированной ДНК.

Заключение

У обследованных лиц с семейным анамнезом заболевания, но без клинических признаков РМЖ, по результатам скринингового исследования слюны выявлены ассоциированные с опухолью мутации в гене BRCA1, что может представлять информацию для раннего выявления, оценки молекулярной гетерогенности заболевания, его прогноза. Сочетание с параллельным исследованием слюны и крови может стать основой разработки эффективных тактик скрининговых и ранних диагностических исследований.

Таким образом, генетическое тестирование изменений в генах BRCA1/2 может использоваться для прогнозирования индивидуального риска развития РМЖ у пациентов с семейным анамнезом наследственного рака груди. Исследование мутации в генах BRCA1/2 в качестве маркеров генетических признаков, ассоциированных с РМЖ, показало в 100% случаев совпадение результатов исследования периферической венозной крови и ротовой жидкости.