Микробиота тонкой кишки у девочек-подростков, страдающих ожирением

Таблица 1. Численность некоторых представителей микробиома пристеночного слоя тонкой кишки у девочек-подростков с ожирением, кл/г × 105

Таблица 2. Численность некоторых представителей микробиома пристеночного слоя тонкой кишки у девочек-подростков без ожирения, кл/г × 105

Таблица 3. Результаты унивариантного ROC-анализа независимых переменных (регрессоров) Candida spp. и Nocardia asteroides

Рис. 1. ROC-кривые, характеризующие связь независимых переменных Candida spp. и Nocardia asteroids с зависимой переменной «ожирение»

Рис. 2. Мультивариантная логистическая модель в программе MedCalc V.19

Рис. 3. ROC-кривые для независимых переменных Candida spp. и Nocardia asteroids, зависимая переменная – ожирение

Рис. 4. График вероятности распределения микробиоты в логистической модели (Х1 – значения Candida spp., Х2 – значения Nocardia asteroides, точки значений переменных на плоскости)

Введение

Проблема ожирения не теряет своей актуальности на протяжении последних десятилетий [1, 2]. При этом значительную долю занимает детское ожирение. Согласно данным Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ), с 2020 г. число случаев развития ожирения среди детей может возрасти более чем вдвое и к 2035 г. составить около 208 млн среди мальчиков и 175 млн среди девочек [3].

Ожирение напрямую связано с различными социальными и медицинскими проблемами [4, 5]. В последних популяционных исследованиях показано, что наличие ожирения у девочек в пубертатном периоде в 2,7 раза увеличивает риск репродуктивных нарушений, что может отразиться на демографических показателях [6, 7].

Ожирение имеет сложный и не до конца изученный этиопатогенез. В его развитии участвуют сотни генов и факторов внешней среды. На сегодняшний день в различных экспериментальных и клинических исследованиях доказана роль состава и функции микробиоты кишечника (МК) [8].

На сегодняшний день микробиота человека рассматривается как экстракорпоральный орган, который задействован в поддержании гомеостаза, обладает высокой метаболической и иммунологической активностью и определяет состояние здоровья всего макроорганизма. При изменении качественного и количественного состава МК, уменьшении ее разнообразия повышается метаболическая активность с образованием дополнительной энергии от съеденной пищи. Кроме того, МК влияет на энергобаланс за счет воздействия на гены, регулирующие расход и запас энергии. В конечном итоге развивается хроническое вялотекущее воспаление. Бактериальные эндотоксины участвуют в созревании компонентов иммунной системы, обусловливая способность к нейтрализации и элиминации патогенов. В то же время измененная в силу разных причин проницаемость кишечного барьера и следующая за этим транслокация микробов в несвойственные им эпитопы могут стать причиной воспаления различной интенсивности [9, 10].

Изменения МК, ассоциированные с ожирением, неоднозначны. Одни авторы указывают на связь с различными филами, другие – с отдельными бактериальными таксонами, что можно объяснить различиями в этнических группах, рационе и образе жизни участников исследований, а также протоколов исследований. При этом исследования у детей малочисленны.

Целью нашей работы стало выявление особенностей микробиома тонкой кишки у девочек-подростков с ожирением с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров крови.

Материал и методы

Стадии исследования соответствовали законодательству РФ, международным этическим нормам и нормативным документам исследовательских организаций. Исследование проводилось после подписания законными представителями детей информированного согласия на участие в исследовании.

Проведено стандартное клинико-лабораторное обследование 72 девочек в возрасте от 12 до 17 лет, 36 из которых страдали ожирением различной степени тяжести. Эти девочки составили первую группу. Во вторую группу вошли 36 детей без ожирения.

С учетом рекомендаций ВОЗ ожирение и его степень диагностировали с помощью величины стандартных отклонений индекса массы тела (SDS ИМТ) [11].

На момент включения в исследование у всех девочек отсутствовали острые и тяжелые хронические заболевания, в том числе патология желудочно-кишечного тракта. В течение шести месяцев до обследования никто из них не получал антибактериальные, пробиотические или пребиотические препараты.

Состояние пристеночной микробиоты тонкой кишки оценивалось с помощью газовой хромато-масс-спектрометрии крови (МСММ) по авторской методике Г.А. Осипова. Данный диагностический метод сертифицирован Росздравнадзором (разрешение ФС 2010/038 от 24.02.2010).

МСММ – высокочувствительный и достоверный метод детектирования микрофлоры по видоспецифическим высшим жирным кислотам клеточной стенки микроорганизмов. Данное исследование позволяет определить более 50 видов бактерий, три вида грибов и три вида вирусов из группы герпесов, а также доминантные виды микроорганизмов в количественном эквиваленте. Для МСММ нет ограничений по локализации забора биоматериала. Она является универсальным методом скрининг-исследования, который указывает на изменения состава микробиоты желудочно-кишечного тракта, характеризуя индивидуальные особенности профиля нормофлоры. Кроме того, она имеет некоторые преимущества перед метагеномным секвенированием 16S рРНК [12].

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программ IBM SPSS Statictics 26, MedCalc V.19. Количественные данные по микроорганизмам были представлены в виде медианы и первого и третьего квартилей (Ме [Q1; Q3]), так как гипотеза о нормальности распределения в выборке была отвергнута (критерий Шапиро – Уилка). Для сравнения результатов групп применялся критерий Манна – Уитни. При уровне p < 0,05 они считались статистически значимыми.

В работе был использован логистический регрессионный анализ с построением логистической модели взаимосвязи представителей МК с ожирением, а также ROC-анализ для определения влияния количественного содержания микроорганизмов на зависимую переменную (ожирение).

Графическое представление данных выполнено с помощью программы Jamovi [13].

Результаты и их обсуждение

Все девочки находились в одинаковых условиях по характеру и кратности питания, пищевым предпочтениям и питьевому режиму.

Стереотип питания характеризовался высокой частотой приемов пищи, большим объемом съедаемых порций, наличием перекусов и ночных приемов пищи.

При анализе качественных характеристик рациона отмечено избыточное употребление мясных полуфабрикатов, сладких молочных продуктов, газированных напитков, кондитерских изделий, дефицит овощей. Количество дополнительной чистой питьевой воды составляло 1–1,5 л/сут.

Рост девочек с ожирением составлял 167,5 [164; 172] см, масса тела – 93,5 [82; 105] кг, ИМТ – 33 [30; 38] кг/м², SDS ИМТ – 2,7 [2,4; 4,9]. Из 36 обследованных у пяти имело место ожирение первой степени, у шести – второй степени, у восьми – третьей степени, у 17 – морбидное ожирение. У девочек без ожирения антропометрические параметры были следующими: рост – 166 [160; 168] см, масса тела – 56 [52; 66] кг, ИМТ – 28 [19; 24] кг/м², SDS ИМТ – 0,6 [0,2; 0,8].

Половое развитие всех девочек, определяемое по формуле Таннера, соответствовало третьей – пятой стадии.

По результатам МСММ, у девочек с ожирением по сравнению с девочками с нормальной массой тела выявлены значимые различия микробиоты тонкой кишки (табл. 1 и 2).

Ориентируясь на численность отдельных микроорганизмов в сложнокомпонентном составе микробного сообщества кишечника и их свойства, можно оценить ожидаемые метаболические последствия.

У девочек с ожирением в отличие от девочек без ожирения доминировали только два вида микроорганизмов – Nocardia asteroides и Candida spp. Так, их представленность оказалась в 1,5 и 3,8 раза выше. Девять видов микроорганизмов, включая грибы и вирусы, у пациенток с ожирением выявлялись в статистически значимо меньшем количестве, чем у относительно здоровых детей, – в 1,2–4,5 раза.

Nocardia asteroides (род Actinobacteriа) – грамположительная бацилла, облигатный аэроб, частично кислотоустойчивая. Является возбудителем пневмонии и диссеминированных инфекций [14]. Данные о ее роли в развитии ожирения отсутствуют.

Candida spp. выделяет токсины, которые ослабляют иммунную систему. При определенных условиях вызывает кандидоз [14].

Alcaligenes spp. (род Proteobacteriа) – грамотрицательные палочки, облигатный аэроб, способный утилизировать ацетат, пропионат, бутират, цитрат, аланин. Защелачивает питательные среды, содержащие белки или их производные [14].

Eggerthella lentа (род Actinobacteriа) – грамположительные анаэробные, палочкообразные, неподвижные бактерии. Заселяют желудочно-кишечный тракт, женскую репродуктивную систему. Деконъюгируют желчные кислоты. Участвуют в развитии смешанных инфекций при абсцессе печени, бактериальном вагинозе, менингите, встречаются при воспалительных заболеваниях кишечника, болезни Грейвса [14].

Pseudonocardia spp. (род Actinobacteriа) – малоизученная грамположительная бактерия. Является перспективным источником новых антибиотиков и обладает мощным ферментативным аппаратом, антимикотическими свойствами [14].

Rhodococcus spp. (род Actinobacteriа) – факультативные внутриклеточные актинобактерии, способные персистировать и вегетировать в макрофагах и других клетках высших организмов, вызывая их разрушение. Результирующее действие родококков приводит к поражению тканей, аналогичному действию микобактерий туберкулеза. Они вырабатывают ферменты, гидролизующие липиды (например, холестеролоксидазу), которые токсичны для организма человека. Участвуют в синтезе стероидов, деградации ксенобиотиков [14].

Staphylococcus spp. (род Firmicutes) – неподвижные шарообразные клетки. Являются довольно распространенными представителями микробиома человека. Вызывают множество заболеваний, в том числе поверхностные и глубокие гнойные инфекции, инфекции мочевых путей, интоксикации.

Aspergillus spp. – высокоаэробные виды микроорганизмов, которые растут на богатых углеродом субстратах, таких как глюкоза и амилоза. Аспергиллы признаны распространенным заражающим фактором крахмалистых продуктов (хлеба и картофеля). В кишечнике не растут, только выделяются [14].

Micromycetes spp. (ситостерол) и Micromycetes spp. (кампестерол) широко распространены в окружающей среде – в почве, воде, воздухе, на внутренних стенах жилых и производственных помещений. Образуют мицелий, повреждают субстрат адгезии. Превосходят все прочие микроорганизмы по продукции антибиотиков и витаминов, обладают мощным ферментативным аппаратом [14].

Herpes simplex вызывает распространенную инфекцию, которая проявляется на коже и слизистых группами пузырьков с жидкостью.

Для оценки связи представителей МК с ожирением использован логистический регрессионный анализ с построением логистической модели.

Зависимая бинарная переменная – ожирение. Определена корреляция независимых переменных: при наличии регрессоров с коэффициентом взаимной корреляции более 0,7 выбирается один из них, исходя из логики рассуждений, либо с наименьшим уровнем значимости.

Выбор независимых переменных (регрессоров): в мультивариантную модель включают переменные с уровнем значимости при унивариантном анализе p < 0,1.

Из всех регрессоров данному требованию отвечали две переменные – Candida spp. и Nocardia asteroides.

Дискриминантная функция Z:

Z = β0 - β1 × Х1 + β2 × Х2, где β0 – константа, а β1 и β2 – стандартные коэффициенты регрессии (β0 = 0,82229, β1 = -0,0054554 и β2 = 0,0047497);

Х1 – среднее значение переменной Candida spp.;
Х2 – среднее значение Nocardia asteroides.

В модели используется логистическое преобразование дискриминантной функции, характеризующее вероятность принадлежности каждого конкретного наблюдения к группе ожирения:

Р = 1 : (1 + e^-Z),  где e – основание натурального логарифма (е ≈ 2,718).

Логистическая функция может принимать значения от нуля до одного.

Рассчитана вероятность принадлежности к первой группе (ожирение) – р = 0,609.

Таким образом, если переменная менее 0,609, она относится к группе без ожирения, если более 0,609 – к группе ожирения.

Для определения влияния количественного содержания микроорганизмов (микробиоты кишечника) на зависимую переменную (ожирение) выполнен унивариантный ROC-анализ. Разделяющую величину количественного содержания в точке cut-off определяли по наивысшему значению индекса Юдена.

Точность модели составила 90,2%, статистическая достоверность – р < 0,0001. Площадь под ROC-кривой – 0,930 ± 0,0387 (95%-ный доверительный интервал (ДИ) 0,834–0,979), что оценивается как отличное. Чувствительность при прогнозировании ожирения – 91,43% (32 случая из 35), специфичность – 88,46% (23 случая из 26) (табл. 3, рис. 1).

Установлена взаимосвязь независимых переменных с ожирением.

В модели выбрана объясняющая переменная, соответствующая Candida spp.

Площадь под ROC-кривой, соответствующей связи между Candida spp. и ожирением, составила 0,862 (95% ДИ 0,752–0,936). Полученная модель была статистически значимой (p < 0,0001). Порог отсечения Candida spp. в точке cut-off составил ≤ 620,2. Величина ≤ 620,2 ассоциирована с ожирением. Чувствительность модели – 88,5%, специфичность – 78,4%.

Указанные переменные включены в мультивариантную логистическую регрессионную модель, представленную на рис. 2.

Параметры модели: уровень статистической значимости – p < 0,0001, чувствительность – 88,5%, специфичность – 91,4%, точность – 90,2%.

На рисунке 3 представлены ROC-кривые для независимых переменных Candida spp. и Nocardia asteroids, зависимая переменная – ожирение.

График вероятности распределения микробиоты по средним значениям в группах Candida spp. и Nocardia asteroides представлен на рис. 4. Выполнена стратификация поверхности графика цветом.

Построенная математико-статистическая модель взаимосвязи свидетельствует о том, что два вида микроорганизмов, в частности Candida spp. и Nocardia asteroides, ассоциируются с развитием ожирения у девочек в пубертатном периоде. Логистическая модель обладает высокой точностью, чувствительностью и специфичностью и может быть использована на практике (p < 0,0001, AUC = 0,930, 95% ДИ 0,834–0,979). ROC-анализ выявил влияние количественного содержания Candida spp. и Nocardia asteroides на возникновение ожирения в данной популяции.

Выводы

Согласно данным газовой хромато-масс-спектрометрии микробных маркеров крови, у девочек-подростков с ожирением можно выделить следующие особенности микробиома тонкой кишки.

1. Избыточный рост Nocardia asteroides и Candida spp. Именно эти микроорганизмы связаны с ожирением. Так, с увеличением их количества возрастает вероятность развития ожирения.
2. Преобладание дисбиотических нарушений с преимущественным дефицитом резидентных микроорганизмов представителей всех родов (Actinobacteria, Firmicutes, Proteobacteriа).
3. Значительное снижение количества микроскопических грибов и герпесвирусов. Следовательно, в будущем снижается риск развития вызываемых ими заболеваний.

Необходимо продолжить детальное изучение этого вопроса в дальнейших исследованиях.

Коррекция выявленных нарушений микрофлоры у девочек в подростковом возрасте позволит осуществить метаболическое программирование их репродуктивного здоровья на последующие годы жизни.