Микросателлитная нестабильность при раке желудка: основы и клиническое применение

Введение

Рак желудка (РЖ) занимает одну из ведущих позиций в структуре онкологической смертности [1]. РЖ относится к гетерогенным заболеваниям и имеет различный прогноз, что требует персонализированного подхода к ведению пациентов [2].

В настоящее время определение прогностических факторов основано на стадии заболевания и патоморфологических характеристиках опухоли [3]. Широкое применение технологии секвенирования следующего поколения (NGS) облегчило молекулярную классификацию злокачественных опухолей [4], что позволило определить сложный геномный ландшафт РЖ. Кроме того, молекулярные методы могут служить потенциальным инструментом для более эффективных терапевтических стратегий и стратификации риска рецидива [5].

Авторы Атласа ракового генома (Cancer Genome Atlas, TCGA) и эксперты Азиатской группы исследования рака (Asian Cancer Research Group, ACRG) на основании анализа профиля мутаций и уровня экспрессии генов предложили две отдельные молекулярные классификации РЖ [4]. Несмотря на различные подходы к анализу, обе научные группы в предлагаемых классификациях выделили в отдельную популяцию РЖ, связанный с микросателлитной нестабильностью (МСН) [6].

МСН представляет собой отражение нарушения системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов, которое обусловливает иммуногенность опухолей с данной альтерацией [7]. Показано, что опухоли с МСН представляют собой особый подтип злокачественных новообразований с высокой чувствительностью к ингибиторам контрольных точек иммунного ответа (ИКТИО) [7]. Более того, в ряде исследований продемонстрирована роль МСН в качестве маркера благоприятного прогноза, в том числе у пациентов с РЖ. Рассмотрим молекулярные основы и возможности клинического применения МСН при РЖ.

Молекулярные основы микросателлитной нестабильности

Микросателлиты (короткие тандемные повторы) представляют собой разбросанные по всему геному короткие последовательности ДНК длиной 1–6 нуклеотидов, повторяющиеся до нескольких десятков раз [8]. Микросателлиты локализуются, как правило, в некодирующих областях. Каждый микросателлит состоит из двух частей – периферической и центральной. Изменение количества повторов в последней определяет специфичность микросателлита [8].

Повторяющиеся последовательности, в частности микросателлиты, особенно склонны к ошибкам по типу «проскальзывания» полимеразы (slipped strand mispairing, SSM) [9]. Во время репликации ДНК область микросателлитной последовательности между новой и матричной цепью может быть ошибочно спарена. Это становится причиной моментального разделения двух цепей и формирования своеобразной стабильной одноцепочечной структуры из повторов [9]. После этого полимераза повторно достраивает цепь в том месте, где прежде уже были присоединены нуклеотиды из-за наличия шпильки [9]. В нормальных клетках неспаренные нуклеотиды распознаются и иссекаются с помощью системы репарации ошибочно спаренных нуклеотидов (mismatch repair system, MMR) [10]. Система MMR включает в себя белки MLH1, MLH3, MSH2, MSH3, MSH6, PMS1, PMS2 [10].

В опухолевых клетках возникают герминативные и соматические мутации в одном или нескольких генах данной системы, что вызывает дефицит MMR (dMMR). Наличие герминативных мутаций в генах MLH1, PMS2, MSH2, MSH6 и EPCAM (делеция в 3’-конце этого гена становится причиной метилирования и инактивации гена MSH2) приводит к развитию синдрома Линча, на долю которого приходится 1,6% всех случаев РЖ [11]. При наследственном РЖ часто обнаруживаются герминативные мутации в генах MLH1 и MSH2 [12, 13]. Однако в большинстве случаев дефицит MMR обусловлен соматическими мутациями: из них более 50% – метилирование промоторной области гена MLH1 [11], 12–15% – мутации в генах MLH1 и MSH2 [12]. dMMR связывают также с метилированием промоторной области гена MSH2 и подавлением экспрессии генов MMR с помощью микроРНК [14].

Дефицит MMR способствует накоплению indel (insertion/deletion)-мутаций и соответственно изменению последовательности нуклеотидов в повторяющихся участках, в частности микросателлитах [15]. Таким образом, феномен МСН является следствием дефектной системы MMR [15]. МСН – одно из ведущих звеньев патогенеза опухолей с dMMR [16]. МСН может возникать в регуляторных областях онкогенов и генов-супрессорах опухоли, ответственных за регуляцию клеточного цикла, апоптоз (TGFβ RII, IGFIIR, TCF4, RIZ, BAX, FAS, BCL10 и APAF1) и поддержание целостности генома (MED1, ATR и MRE11) [14, 17].

В результате появления МСН в кодирующем регионе возникают мутации по типу сдвига рамки считывания [18], что становится причиной синтеза нефункциональных белков, или неоантигенов. Измененные белки представляются молекулами человеческого лейкоцитарного антигена (HLA класса) I на поверхности опухолевых клеток, что служит мишенью для CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов [18].

Образованием большого количества неоантигенов в опухолях с МСН объясняется наличие особого воспалительного микроокружения опухоли [19]. Показано, что у пациентов с РЖ наличие МСН ассоци­ируется с высоким уровнем опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов (ОИЛ) [20, 21]. Высокая плотность CD8+ и FOXP3+ ОИЛ связана с увеличением общей выживаемости (ОВ) у больных РЖ с МСН [22, 23].

Согласно результатам другого исследования, высокий уровень CD3+ и CD8+ ОИЛ служит положительным прогностическим фактором при МСН-положительном РЖ [24].

В опухолях желудка с МСН обнаружена высокая экспрессия PD-L1. L. Gu и соавт. в ходе метаанализа установили, что у больных РЖ с МСН статистически значимо чаще имеет место положительный статус PD-L1 по сравнению с пациентами с РЖ без МСН (отношение рисков (ОР) 6,09; 95%-ный доверительный интервал (ДИ) 2,44–15,25; p = 0,0001) [25].

Таким образом, описанные механизмы обусловливают высокую иммуногенность опухоли и, как следствие, эффективность ИКТИО.

Методы обнаружения МСН

Золотым стандартом обнаружения dMMR и МСН признано иммуногистохимическое (ИГХ) и молекулярно-генетическое исследование соответственно [6]. ИГХ-метод демонстрирует высокую специфичность и чувствительность к опухолям, ассоциированным с синдромом Линча [26]. С помощью ИГХ-исследования dMMR выявляется при определении экспрессии четырех ключевых белков системы MMR (MLH1, MSH2, MSH6 и PMS2) либо только двух (MSH6, PMS2) [27]. Два подхода характеризуются аналогичной чувствительностью в отношении оценки dMMR [26].

Альтернативой ИГХ-исследованию служит исследование МСН с использованием методов, в основе которых лежит полимеразная цепная реакция (ПЦР) и которые позволяют установить изменение размеров микросателлитов. К основным преимуществам молекулярно-генетического подхода относится возможность изучения материала при неопределенном результате и преаналитических ограничениях для проведения ИГХ-исследования. Кроме того, методы на основе ПЦР позволяют определять ложноотрицательные результаты ИГХ-тестирования, вызванные редкими мутациями в генах системы репарации, не затрагивающими антигенность белков.

Изначально МСН выявляли с помощью ПЦР-панели, позволявшей определять изменения двух мононуклеотидных областей микросателлитов (BAT-25, BAT-26) и трех динуклеотидных (D5S346, D2S123, D17S250) [28]. Консенсусом Европейского общества медицинской онкологии (European Society for Medical Oncology, ESMO) по тестированию опухолевого материала на наличие МСН предусмотрено применение панели, содержащей пять мононуклеотидных повторов: BAT-25, BAT-26, NR-21, NR-24, NR-27 [27]. Такая панель в отличие от панели с динуклеотидными повторами обладает высокой специфичностью и требует парного исследования неизмененной ткани для сопоставления длины микросателлитов [27]. Согласно рекомендации ESMO, подразделение МСН на уровни более неприменимо [27].

Альтернативной молекулярно-генетической стратегией определения МСН является NGS-тестирование [8]. Однако высокая стоимость и сложности с интерпретацией результатов ограничивают доступность данного метода в клинической практике [29].

Клинико-морфологические особенности опухолей с микросателлитной нестабильностью

Распространенность МСН при РЖ варьируется от 5 до 28% [30, 31], что обусловлено популяционными особенностями анализируемых когорт, различиями в стадиях изучаемых опухолей и использованием различных методов обнаружения МСН. В недавнем систематическом обзоре M. Lorenzi и соавт. показано, что распространенность РЖ с МСН составляет 11% (95% ДИ 9–12) [32–34].

В метаанализе, включавшем 48 исследований, продемонстрировано, что МСН при РЖ ассоциируется с женским полом (ОР 1,57; 95% ДИ 1,31–1,89; р < 0,001), пожилым возрастом (≥ 65 лет) (ОР 1,58; 95% ДИ 2,20–1,13; р < 0,001), дистальной локализацией опухоли (ОР 0,38; 95% ДИ 0,32–0,44; р < 0,001), отсутствием метастазов в лимфатических узлах (ОР 0,70; 95% ДИ 0,57–0,86; р < 0,001), I–II стадиями заболевания (ОР 1,77; 95% ДИ 1,47–2,13; р < 0,001) [36]. Еще одной клинической особенностью МСН является преобладание 1-го и 2-го типа опухолей, согласно классификации R. Borrman [6, 15].

Установлена также взаимосвязь между МСН и гистологическим типом карцином, в соответствии с классификацией Lauren: МСН обнаружена в 10,7% случаев опухолей кишечного типа, в 0,9% – смешанного и 2,9% случаев – диффузного типа [35]. Это подтверждает связь МСН с наличием опухоли кишечного типа. К иным морфологическим особенностям МСН относится наличие опухоль-инфильтрирующих лимфоцитов и муцинозного компонента [34].

Прогностическое значение микросателлитной нестабильности

В ряде исследований показано, что МСН может служить маркером благоприятного прогноза у пациентов с РЖ [3]. Согласно молекулярной классификации TCGA, а также ACRG, МСН-положительный подтип ассоциируется с благоприятным прогнозом [6].

K. Polom и соавт. в метаанализе, включавшем 21 исследование с данными о статусе МСН, продемонстрировали, что показатель ОВ достоверно выше при РЖ с МСН, чем при РЖ в отсутствие МСН (ОР 0,69; 95% ДИ 0,56–0,86; p < 0,001) [35]. Однако исследования, включенные в метаанализ, были неоднородны, что в значительной степени связано с использованием различных панелей микросателлитных маркеров для оценки МСН [35].

В ряде крупных рандомизированных клинических исследований на основании апостериорного анализа показана прогностическая роль МСН после хирургического лечения [6]. В этих исследованиях МСН служила независимым предиктором увеличения выживаемости без прогрессирования (ВБП) и ОВ [36, 37].

Поскольку адъювантная или периоперационная химиотерапия является рекомендованным вариантом лечения пациентов с операбельным РЖ, в качестве предиктивного маркера ответа на данную терапию также анализировали роль МСН [6]. J. An и соавт. продемонстрировали возможность прогнозирования эффективности схем на основе 5-фторурацила в адъювантном режиме в зависимости от статуса МСН при наличии негативного края резекции после гастрэктомии [38]. В ходе многофакторного анализа установлено, что выполнение адъювантной химиотерапии у пациентов с РЖ стадий II–III в отсутствие МСН ассоциируется со значимым увеличением ВБП (ОР 0,664; p = 0,008) [38]. Однако преимущество терапии у больных РЖ с МСН не продемонстрировано [38]. У пациентов с РЖ стадий II–III в отсутствие МСН применение капецитабина в комбинации с оксалиплатином в адъювантном режиме имело преимущество в отношении пятилетней ВБП перед отсутствием химиотерапии после хирургического лечения: 66,8 против 54,1% соответственно (p = 0,002) [39].

S. Kim и соавт., проведя многофакторный анализ, пришли к выводу об отсутствии эффективности химиотерапии после гастрэктомии у пациентов с РЖ стадии III при наличии МСН [40].

В апостериорном анализе исследования MAGIC было показано, что наличие МСН имело негативное прогностическое значение у пациентов, получавших хирургическое лечение с последующей химиотерапией: медиана ОВ составила 9,6 месяца в группе МСН и 19,5 месяца в группе без МСН (ОР 2,18; 95% ДИ 1,08–4,42; p = 0,03) [41].

При стадиях IB–II у пациентов с РЖ без МСН отмечалось увеличение ОВ при добавлении химиолучевой терапии (p < 0,001). У пациентов с МСН подобной взаимосвязи не прослеживалось [42]. В свою очередь у пациентов с РЖ стадии III адъювантная химиолучевая терапия приводила к статистически значимому увеличению ОВ по сравнению с только хирургическим лечением независимо от статуса МСН (p < 0,001) [42].

Учитывая низкую распространенность МСН при РЖ и ее взаимосвязь с благоприятными клинико-морфологическими признаками, F. Pietrantonio и соавт. проанализировали прогностическую ценность МСН [43]. В метаанализ были включены данные четырех крупных рандомизированных клинических исследований: MAGIC, CLASSIC, ARTIST и ITACA-S. Согласно результатам многопараметрического анализа, у пациентов с операбельным РЖ с МСН показатели пятилетней ВБП и ОВ превысили таковые у пациентов с отсутствием МСН: ОР 0,48 (95% ДИ 0,33–0,70; p < 0,001) и ОР 0,48 (95% ДИ 0,29–0,81; p = 0,005) соответственно [43]. У пациентов с РЖ без МСН также оказалось эффективным хирургическое вмешательство в комбинации с химиотерапией. В то же время у пациентов с МСН подобное лечение не имело преимущества перед отсутствием адъювантной терапии (p = 0,027) [43]. Прогностическая значимость МСН у пациентов с резектабельным РЖ в зависимости от проводимого лечения представлена в таблице [38–43].

Предиктивная роль при иммунотерапии

В мае 2017 г. Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (Food and Drug Administration, FDA) было одобрено применение анти-PD-1-терапии пембролизумабом у пациентов с распространенным колоректальным раком с МСН, у которых на фоне предшествующей химиотерапии отмечалось прогрессирование заболевания [20]. Независимо от локализации первичной опухоли препарат был также одобрен к применению у пациентов с метастатическим заболеванием с МСН, не имеющих альтернативных вариантов лечения. Основанием для одобрения послужили предварительные результаты исследований KEYNOTE-012, -016, -028, -158 и -164, которые включали 149 пациентов с МСН-положительной опухолью [44]. Из них 90 пациентов имели колоректальный рак, 59 – одну из 14 других локализаций первичной опухоли. У 78% пациентов отмечалась продолжительность ответа в течение шести и более месяцев [44]. Частота объективных ответов (ЧОО) составила 39,6% (95% ДИ 31,7–47,9) [45]. При МСН-положительном колоректальном раке ЧОО достигла 36%, при других локализациях – 46% [44]. По данным пяти исследований, в группе неколоректального рака наибольшая ЧОО зафиксирована у пациентов с РЖ – 56% (95% ДИ 21–86), длительность ответа варьировалась от 5,8+ до 22,1+ месяца [45].

В исследовании KEYNOTE-059 у ранее леченных пациентов с распространенным РЖ, получавших ИКТИО, в МСН-положительных случаях (n = 7) ЧОО составила 57,1% (95% ДИ 18,4–90,1), МСН-отрицательных (n = 167) – 9% (95% ДИ 5,1–14,4) [46].

Согласно данным S. Kim и соавт., у семи пациентов с метастатическим МСН-положительным РЖ при использовании пембролизумаба ЧОО достигла 85,7% [47].

В исследовании A. Marabelle и соавт. пембролизумаб продемонстрировал эффективность у пациентов, не ответивших на стандартную химиотерапию [47]. У 24 пациентов с МСН-положительным РЖ ЧОО составила 45,8% (95% ДИ 25,6–67,2), а ВБП – 11 месяцев (95% ДИ 2,1 месяца – значение не достигнуто) [48].

В подгрупповом анализе исследования CHECKMATE-032 также показано, что ЧОО и 12-месячная ОВ у пациентов с распространенным РЖ с МСН, получавших анти-PD-1-терапию ниволумабом (n = 7), выше, чем у пациентов без МСН (n = 18): 29 против 11% и 57 против 33% соответственно [49].

Несмотря на многообещающие результаты апостериорного анализа описанных выше клинических исследований, количество пациентов, данные которых проанализированы, не так много. Кроме того, отмечается большая вариабельность доверительного интервала при оценке конечных точек выживаемости.

Данные метаанализа, включавшего исследования фазы III KEYNOTE-062, CheckMate-649, JAVELIN Gastric 100 и KEYNOTE-061, подтвердили эффективность применения ИКТИО в монорежиме либо в комбинации с химиотерапией у больных РЖ с МСН [50]. Из 2545 пациентов с РЖ, у которых оценивали статус МСН, 123 (4,8%) имели МСН. Показано преимущество анти-PD-1-терапии в отношении ОВ перед химиотерапией в зависимости от статуса МСН: при наличии МСН ОР составило 0,34 (95% ДИ 0,21–0,54), в отсутствие МСН – 0,85 (95% ДИ 0,71–1,00). При этом эффективность ИКТИО в двух подгруппах существенно различалась (p = 0,003). При использовании схем на основе ИКТИО наличие МСН также ассоциировалось с увеличением ВБП и ЧОО: ОР составило 0,57 (95% ДИ 0,33–0,97; p = 0,04) и 1,76 (95% ДИ 1,10–2,83; p = 0,02) соответственно [50]. Однако, согласно метаанализу, в клинических исследованиях не представлены данные о ВБП и ЧОО у пациентов без МСН, что не позволяет непосредственно сравнить различия этих контрольных точек между двумя подгруппами [50].

Заключение

МСН является перспективным маркером прогноза у пациентов с локализованным и местнораспространенным РЖ, а также предиктором эффективности ИКТИО в случаях распространенного РЖ.