Разработка электрохимического аптасенсора для выявления возбудителя коронавирусной инфекции

Рис. 1. Пример построенной эквивалентной схемы с подобранными программой ZView 3.5g значениями и указанием точности подбора

Рис. 2. Диаграммы Найквиста (кривые годографа), зарегистрированные для всех экспериментальных образцов в растворе ГЦФ

Рис. 3. Эквивалентные схемы для данных, снятых в растворе PBS (А) и ГЦФ (Б), построенные в программе ZView 3.5g так, чтобы модельные и экспериментальные графики Найквиста совпадали для аптасенсора Apt31 до/после контакта с пробой

Полученные в результате моделирования величины параметра CPE-P для проб COVID-19(+) и COVID-19(-) пациентов на основании данных, зарегистрированных в растворах PBS и ГЦФ

Рис. 4. Диаграмма распределения значений параметра Rp (А) и СPE1-T (Б) для COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб и раствора человеческого альбумина при использовании раствора ГЦФ

Рис. 5. Диаграмма распределения значений параметра ∆Rp (А) и ∆CPE1-T (Б) для COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб и раствора человеческого альбумина при использовании раствора ГЦФ

Рис. 6. Диаграммы распределения значений параметра Incr Rp для COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб и раствора человеческого альбумина при использовании растворов ГЦФ (А) и PBS (Б)

Рис. 7. Диаграммы распределения значений параметра Incr CPE1-T для COVID-19(+) и COVID-19(-)-проб и раствора человеческого альбумина при использовании растворов ГЦФ (А) и PBS (Б)

Введение

Вирус SARS-CoV-2, индуцировавший пандемию COVID-19, эволюционировал в сторону менее смертельно опасных для человека, но более контагиозных и угрожающих здоровью штаммов [1]. Создание эффективных средств раннего выявления вируса остается актуальным, а полученные при этом знания и опыт могут быть использованы для разработки новых препаратов, приборов и методов борьбы с иными вирусными инфекциями. Одними из наиболее перспективных и чувствительных методов диагностики, в том числе вирусных инфекций, являются электрохимические методы [2, 3]. Электрохимические сенсоры обладают рядом преимуществ перед традиционными аналитическими методами, включая высокую селективность, чувствительность, надежность, простоту эксплуатации, кратковременность измерения, портативность, низкую стоимость и т.д. [4].

Сенсоры, состоящие из аптамеров в качестве элемента распознавания, называются аптасенсорами. Аптамеры – одноцепочечные ДНК/РНК-олигонуклеотиды, которые отбираются путем систематической эволюции лигандов за счет экспоненциального обогащения (SELEX) in vitro [5]. Аптамеры обладают высокой специфичностью и сродством к широкому спектру веществ-мишеней, включая ионы металлов, биологические малые молекулы, белки, экзосомы, клетки и патогенные микроорганизмы [6]. Таким образом, они представляют собой многообещающий альтернативный элемент биомолекулярного распо­знавания. Уникальные особенности аптамеров, в том числе простой синтез, мультиплексированная функционализация и высокая стабильность, способствуют их широкому применению в области аналитической химии. Электрохимические аптасенсоры обеспечивают высокую чувствительность, специфичность и скорость отклика. Они просты, надежны и имеют относительно низкую стоимость [7]. Принцип их функционирования обусловлен изменением тока, импеданса или потенциала в ответ на событие распознавания на преобразователе датчика [8].

В рамках борьбы с новой коронавирусной инфекцией получено большое число аптамеров, специфичных к их двум важным структурным белкам – белку шипа (S) и белку нуклеокапсида (N), потенциально пригодных для разработки диагностических тестов [9, 10].

В работе исследованы перспективы получения электрохимических аптасенсоров и их применения в сочетании с методом спектроскопии электрохимического импеданса (СЭИ) для индикации SARS-CoV-2 в биологических пробах. При создании аптасенсора был использован аптамер Apt31, состоящий из 31 нуклеотида, способный блокировать рецептор-связывающий домен (RBD) шиповидного белка коронавируса [10].

Материал и методы

Подготовка рабочих электродов

Подготовка рабочих золотых электродов включала в себя механическую и электрохимическую обработку поверхности. Вначале электроды шлифовали корундовой абразивной пастой, разведенной небольшим количеством воды, затем промывали раствором поверхностно-активного вещества и дистиллированной водой для удаления пасты с поверхности электродов. После этого электроды обрабатывали ультразвуком в спирте в течение десяти минут. Для травления поверхности электроды помещали в свежеприготовленный раствор H₂SO₄:Н₂O₂ (3:1) на пять минут, далее промывали и сушили в токе азота. Для электрохимической обработки использовали электрохимическую станцию CHI-660D (CH Instruments, США). Рабочий электрод, вспомогательный платиновый электрод и электрод сравнения Ag/AgCl (1 М KCl) помещали в ячейку с фосфатным буфером (рН 7,4), после чего проводили циклирование до постоянного сигнала в диапазоне потенциала от 0,8 до -1,4 В. Затем проводили электрохимическую обработку при выдерживании постоянного потенциала, снимали данные с чистых электродов и повторяли электрохимическую обработку.

Подготовка аптасенсора

Аптамер Apt31 (5’-CGGATGGAAT TTTG TTC GTTG ATTCCATCCG-3’), использованный для создания аптасенсора, разработанный методом in silico, подробно описан V. Mironov и соавт. [10]. Для связывания аптамера Apt31 с золотой поверхностью электрода использовали метод хемосорбции, который заключался в прямой иммобилизации аптамера, модифицированного тиоловой группой, на поверхность электрода. Такой метод позволял формировать прочные ковалентные связи (около 50 ккал/моль) между атомами серы и золота, в результате чего образовывался стабильный и гибкий самособирающийся монослой с повторяющимися аптамерами. Связывание аптамера с золотой поверхностью рабочего электрода проводили сразу после электрохимической обработки, для чего на электрод помещали 20 мкл аптамера Apt31 (1 мкМ). Электрод помещали в чашку Петри с влажной атмосферой, герметично закрывали и выдерживали при 4 °С в течение 12 часов. Перед формированием монослоя конформацию аптамеров Apt31 обязательно восстанавливали. Для этого аптамеры в течение десяти минут нагревали при температуре 95 °С, затем сразу охлаждали на льду в течение пяти минут.

Подготовка экспериментальных биологических образцов

В качестве биологического материала для определения возбудителей COVID-19 использовали клинические образцы, представляющие собой лизированные мазки со слизистой оболочки ротоглотки здоровых людей и больных с подтвержденным диагнозом (ПЦР-исследование) COVID-19 (30 образцов). Образцы исследовали на базе Университетской клиники семейной медицины Красноярского государственного медицинского университета им. профессора В.Ф. Войно-Ясенецкого  (руководитель – доцент Д.С. Каскаева). До использования клинические образцы хранили при температуре -20 °С. Перед началом эксперимента исследуемые пробы выдерживали при комнатной температуре в течение 30 минут. 0,003%-ный раствор альбумина готовили из раствора для инфузий (ГБУЗ СО «ССПК», Россия).

Электрохимические методы исследований

Для оценки качества подготовки золотой поверхности электрода – чистоты, стабильности, воспроизводимости, повторяемости и мониторинга иммобилизации аптамеров на поверхности электрода использовали метод циклической вольтамперометрии. В качестве метода диагностики использовали СЭИ, поскольку этот метод позволяет проводить безметочное высокочувствительное обнаружение малых концентраций биоаналитов и обеспечивает возможность миниатюризации аптасенсора [11].

Процедура электрохимического анализа

Электрохимические измерения и электрохимическую обработку электродов выполняли в трехэлектродной ячейке, включающей рабочий электрод (золотой дисковый электрод диаметром 2 мм, CH Instruments, США), вспомогательный электрод (платиновая проволока) и электрод сравнения (хлорид-серебряный электрод с 1 М KCl) (ООО «НПП «Томьаналит», Россия) с помощью электрохимической станции CH-600D (CH Instruments, США). Фоновым электролитом в исследовании служил фосфатный буфер (PBS) c pH 7,4 (VWR Life Science AMRESCO, США), в качестве раствора редокс-медиатора использовали 0,025 М раствор гексацианоферратов (II и III) калия (квалификация «хч», ООО «Гранхим», Россия) в фосфатном буфере. Анализ методом СЭИ начинали с предварительной 30-минутной дегазации растворов фосфатного буфера и гексацианоферрата калия (ГЦФ). Перед каждым измерением дегазацию повторяли (5–10 минут).

Измерения проводили в два этапа. На первом этапе снимали данные с аптасенсора, на втором – данные с аптасенсора после нанесения экспериментального образца и его инкубации в течение 30 минут для связывания вирусного белка с аптамерами на поверхности аптасенсора. Кроме того, для исключения мешающего влияния других компонентов пробы проводились измерения с раствором человеческого альбумина (ГБУЗ СО «Свердловская станция переливания крови», Россия) (искусственная слюна). Данные СЭИ снимали при потенциале разомкнутой цепи (для съемок в фоновом электролите фосфатного буфера) и при потенциале превращения редокс-пары (для съемок в растворе ГЦФ) с амплитудой 10 мВ и с изменением частоты в диапазоне 1–100000 Гц.

Построение эквивалентных схем

Для построения графиков в координатах Найквиста использовали программу Origin. Анализ данных СЭИ проводили путем построения эквивалентных схем и статистической обработки полученных данных с целью поиска наиболее оптимального электрохимического параметра, позволяющего отделить сигналы COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб.

Моделирование эквивалентных схем проводили с помощью программы ZView 3.5g (Scribner Associates) [12]. Процесс моделирования начинали с подбора базовых элементов эквивалентных схем, после чего результаты вычислительного моделирования сопоставляли с результатами экспериментальных исследований. Точность полученной модели оценивали по совпадению экспериментальных графиков с fitting-графиками, построенными программой, исходя из предполагаемой эквивалентной схемы, а также с помощью критерия chi-squared, который должен превышать 10–4, и ошибки Error, процентное содержание которой не должно превышать 30%. Величины базовых параметров результатов моделирования заносили в таблицы для статистической обработки. Для анализа использовали абсолютные величины параметров, их разности и величины прироста значений после контакта аптасенсора с пробой (рис. 1).

Разность значений параметров рассчитывали по формуле:

ΔP_i = (P_i^s - P_i^a) (1),

где P_i – параметр, полученный при моделировании

экспериментальных данных;

P^s_i – значение этого параметра для аптасенсора после контакта с пробой;

P^a_i – значение этого параметра для аптасенсора до контакта с пробой.

Прирост параметра рассчитывали по формуле в процентах:

Статистические методы исследований

Достоверность отличий между параметрами оценивали по критерию Стьюдента, Q-критерию [13] или U-критерию Манна – Уитни [14] в зависимости от величины выборки.

Результаты и обсуждение

Для выбора условий электрохимического анализа использовали сравнение диаграмм Найквиста, полученных для COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб в растворах PBS и ГЦФ. Результаты импеданс-спектроскопии на комплексной плоскости представляли собой множество точек, каждая из которых соответствовала значению импеданса, измеренного при разных частотах – годограф импеданса. Анализ диаграмм Найквиста показал, что наиболее подходящим для измерения электрохимического сигнала является раствор гексацианоферрата калия, при котором сопротивление переноса электрона через границу «электрод – раствор» у образцов COVID-19(+) в целом оказался выше, чем у образцов COVID-19(-) (рис. 2).

Для анализа экспериментальных данных электрохимического импеданса (диаграмм Найквиста) использовали программное обеспечение ZView 3.5g, с помощью которого были построены две модели эквивалентных схем, одна из которых позволила описать процессы, происходящие при съемке электрохимического сигнала в фоновом растворе фосфатного буфера, другая – в растворе редокс-медиатора гексацианоферрата калия (рис. 3).

Эквивалентные электрические схемы представляют собой электрические схемы, в которых все влияющие на расчет элементы заменены на их идеальные эквиваленты, а все не влияющие элементы и факторы исключены. Такие схемы являются идеальным приближением реальной схемы для рассматриваемого режима работы. Данные, полученные из эквивалентных схем с помощью моделирования, обрабатывали статистически, чтобы отбросить выпадающие результаты. После этого сравнивали параметры COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб. Путем сопоставления экспериментальных данных и данных, полученных за счет моделирования, были выбраны две наиболее важные компоненты эквивалентных схем – сопротивление переноса электрона (Rp) и емкостный элемент (CPE).

Емкостный элемент СРЕ описывается двумя параметрами – безразмерным CPE-P и CPE-T с размерностью Ом^–1 × с^α. CPE-P позволяет заключить, можно ли связать параметр CPE-T с величиной двойного электрического слоя [15]. Полученные в данной работе значения для CPE-P (таблица) показали, что все значения CPE1-T истинно емкостные.

Значения CPE2-P продемонстрировали сложную природу второго компонента CPE. Поэтому при обсуждении и графическом представлении экспериментальных данных, направленных на выбор методов и параметров, позволяющих уверенно различать их значения между COVID-19(+)- и COVID-19(-)-пробами, были выбраны параметры Rp и CPE1-T. Кроме того, для анализа использовались относительные значения параметров эквивалентной схемы, такие как изменение (Δ) и прирост (Incr) параметра после контакта аптасенсора с пробой. Стоит отметить, что наиболее информативным оказался анализ параметров СЭИ, полученный при использовании раствора ГЦФ (рис. 4).

Абсолютные значения показателя СPE1-T не поз­воляют различить электрохимические сигналы от COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб (рис. 4Б), тогда как значения Rp (рис. 4А) COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб лежат в практически неперекрывающихся областях. Диапазон сопротивления для COVID-19(+)-проб изменялся в пределах 996,3–1437 Ом, а для COVID-19(-) – в пределах 643,8–958,4 Ом. U-критерий Манна – Уитни показал, что полученные различия между выборками достоверны. Следовательно, величина сопротивления переноса электрона Rp на границе раздела «электрод – раствор» позволяет отделить COVID-19(+)-пробы от COVID-19(-)-проб.

Следующими параметрами электрохимических сигналов, включенными в анализ возможных для использования параметров для выявления возбудителей коронавирусной инфекции, стали параметры разности значений (Δ) (рис. 5). Приведенные на рис. 5 результаты демонстрируют возможность выявления возбудителей коронавирусной инфекции как с помощью ΔRp, так и с помощью ΔCPE1-T. Диапазон изменения ΔRp для COVID-19(-) составил 446,4–728,4 Ом, а для COVID-19(+) – 688,1–2529,8 Ом. ΔCPE1-T для COVID-19(-) находился в диапазоне от -8,13 × 10⁷ до 8,53 × 10⁷ Ом, а для COVID-19(+)-проб – в пределах (8,55–12,9) × 10⁷ Ом. U-критерий Манна – Уитни подтвердил достоверность различий ΔRp и ΔCPE1-T между COVID-19(+)- и COVID-19(-)-пробами.

Кроме разности параметров рассчитывали прирост (Incr) параметра – относительное изменение величины параметра после контакта аптасенсора с пробой (%). Можно отметить, что прирост сопротивления переноса электрона Incr Rp в обоих электролитах значимо различался для COVID-19(+)- и COVID-19(-)-проб (рис. 6).

Приросты для параметров Incr CPE1-T дали худшие результаты и не позволили идентифицировать COVID-19(+)-пробы (рис. 7).

В целом результаты анализа экспериментальных данных продемонстрировали, что относительные значения величин сопротивления и емкостной компоненты могут быть потенциально использованы для выявления возбудителей COVID-19 с использованием жидкостной биопсии. Самыми информативными оказались параметры ΔRp и ΔCPE1-T в растворе редокс-медиатора, а также Incr Rp в обоих растворах.

С целью проверки установленных нами закономерностей в изменении параметров был проведен эксперимент с зашифрованными пробами. Он заключался в измерении и расчете относительных величин параметров для зашифрованных проб с последующим сопоставлением полученных данных с установленными ранее диапазонами значений для отрицательных и положительных проб. Зашифровка проб состояла в присвоении номера (шифра) уже известной по своему статусу пробе с целью приближения эксперимента к реальной задаче. Исследования выполнялись в растворе редокс-медиатора. По значению разности СPE1-T и прироста Rp верно были определены четыре пробы из пяти, что говорит о принципиальной возможности использования данных параметров для диагностики COVID-19 методом СЭИ с применением электрохимического аптасенсора на основе аптамера Apt31.

Заключение

Результаты исследований показали, что, исходя из способов подготовки и контроля качества электрохимических аптасенсоров на основе аптамера Apt31, иммобилизованного на поверхности золотого рабочего электрода трехэлектродной электрохимической ячейки, могут быть разработаны:

• метод получения электрохимических аптасенсоров на основе золотых электродов, функционализированных тиолированными аптамерами;
• методы циклической вольтамперометрии для подготовки и контроля качества биосенсорного слоя.

Согласно данным, полученным при исследовании 30 образцов COVID-19(+) и COVID-19(-) пациентов, метод СЭИ позволяет находить в образцах жидкостной биопсии белок RBD, характерный для возбудителя коронавирусной инфекции. В работе определены эквивалентные схемы и установлено, что показатели сопротивления переноса электрона и емкостной компоненты являются наиболее информативными и могут быть использованы для разработки метода выявления возбудителей коронавирусной инфекции.

Исходя из полученных результатов, установлено, что:

• наиболее явное и достоверное различие между COVID-19(+)- и COVID-19(-)-пробами возможно при использовании параметров разности емкостной компоненты (∆СPE1-T) и прироста сопротивления переноса заряда (Incr Rp) при измерении показаний методами СЭИ в растворе редокс-медиатора ГЦФ;
• человеческий альбумин, присутствующий в соскобах слизистой ротоглотки, в предложенном подходе практически не влияет на результаты измерений;
• количество выпадающих результатов существенно снижается при переходе от абсолютных значений параметров (Rp и СPE) к относительным.

Таким образом, показана принципиальная возможность использования аптасенсора на основе тиолированного аптамера Apt31, иммобилизованного на золотом электроде, и метода спектроскопии электрохимического импеданса выявления возбудителей коронавирусной инфекции. 

Благодарности.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Краевого государственного автономного учреждения «Красноярский краевой фонд поддержки научной и научно-технической деятельности», конкурс научно-технических и инновационных проектов в интересах первого климатического научно-образовательного центра мирового уровня «Енисейская Сибирь», грант «Создание электрохимического аптасенсора для диагностики инфекционных и онкологических заболеваний» № 2023091509842 и при поддержке компании-партнера АО «НПП «Радиосвязь».