Цитокиновый статус и эффективность иммунобиологической терапии при ротавирусной инфекции у детей

Таблица 1. Динамика уровня сывороточных иммуноглобулинов и показателей фагоцитоза у детей с ОКИ

Таблица 2. Динамика показателей цитокинового статуса у детей с ротавирусной инфекцией

Таблица 3. Особенности клинического течения ОКИ у детей в зависимости от уровня ИЛ-1-бета в сыворотке крови

Рисунок. Заболеваемость ОКИ и ОРВИ у детей, перенесших ротавирусную инфекцию, при катамнестическом наблюдении в зависимости от проводимого в острый период лечения (достоверных различий нет)

Ротавирусная инфекция является наиболее частой причиной диареи в детском возрасте. По оценкам экспертов Всемирной организации здравоохранения, практически каждый ребенок в течение первых трех – пяти лет жизни переносит ротавирусную инфекцию независимо от расы и социально-экономического статуса [1]. Актуальность данной проблемы определяется не только чрезвычайно широкой распространенностью ротавируса в популяции. Тяжелое течение заболевания сопровождается развитием эксикоза различной степени, нарушениями ферментации углеводов, дисбиозом кишечника, высоким риском осложнений (гиповолемическим шоком, поражением центральной нервной системы), а также возможностью внутрибольничного инфицирования и, как следствие, ухудшением состояния больного и увеличением сроков его госпитализации.

Основные патогенетические механизмы развития осмотической диареи при ротавирусной инфекции в настоящее время хорошо известны. Это прямое цитопатическое действие ротавируса на энтероциты, влияние энтеротоксина, вторичная дисахаридазная, главным образом лактазная, недостаточность и нарушение функций индигенной микрофлоры желудочно-кишечного тракта (ЖКТ), в первую очередь касающихся синтеза короткоцепочечных летучих жирных кислот [2]. Вместе с тем не до конца изучено действие ротавируса на иммунную систему, что может иметь значение для последующего формирования внекишечных проявлений заболевания, хронизации инфекции, ее рецидивов, определения триггера возникновения аутоиммунного поражения ЖКТ. В свою очередь определение особенностей иммуногенеза ротавирусной инфекции позволит теоретически обосновать назначение иммунопрепаратов для лечения детей с этим заболеванием.

При острых кишечных инфекциях (ОКИ) бактериальной этиологии иммунологические сдвиги характеризуются снижением фагоцитарной активности нейтрофилов и содержания общего иммуноглобулина (Ig) M в сыворотке крови [3]. При иерсиниозе отмечается дефицит CD₃ и CD₄ с повышением CD₈ субпопуляций лейкоцитов [4]. При ОКИ, вызванных условно патогенной флорой, наблюдается снижение количества иммунорегуляторных клеток и IgG с одновременным увеличением IgM [5]. Как правило, все ОКИ независимо от этиологии протекают на фоне местной иммуносупрессии и дефицита IgA_s, который связывается с патогенными и условно патогенными микроорганизмами как вирусного, так и бактериального происхождения и препятствует их адгезии на эпителиоцитах кишечника [6].

Особенности функционирования иммунной системы в детском возрасте не позволяют в должной мере защитить слизистую оболочку ЖКТ в частности и организм в целом от воздействия патогенных микроорганизмов. Доказано, что в течение нескольких лет после рождения иммунитет остается несовершенным: у детей количество плазмоцитов, синтезирующих IgA_s, приближается к аналогичному показателю у взрослых только ко второму году жизни, а содержание мукозального IgA – лишь к шести – восьми годам. Иммунная система новорожденного формируется под влиянием контактов с пищевыми и бактериальными антигенами, в том числе с антигенами нормальной индигенной микрофлоры ЖКТ, обладающими иммуномодулирующим эффектом [7].

Иммунитет и микрофлора взаимосвязаны, что подтверждается участием бифидобактерий и лактобацилл в синтезе таких факторов иммунной защиты, как лизоцим, пропердин, комплемент, IgA_s, активация фагоцитоза, стимуляция системы цитокинов и интерферонов [8]. При дисбактериозе I–II степени происходит активация местного иммунитета (повышается уровень IgA_s и лизоцима в копрофильтратах), тогда как при дисбиозе III степени эти иммунные механизмы истощаются, концентрация общих IgA и IgG в сыворотке крови снижается, фагоцитарная активность лейкоцитов угнетается.

Преимущества пробиотиков, содержащих бифидобактерии и лактобациллы, перед другими препаратами заключаются в уникальном сочетании физиологичности и комплексности терапевтического действия, возможности комбинации с другими лекарственными средствами (в том числе антибиотиками) при практически полном отсутствии противопоказаний и побочных эффектов [9, 10]. Колонизация бифидо- и лактофлорой ЖКТ ребенка с момента рождения и поддержание экологического равновесия между макро- и микроорганизмами впоследствии становятся залогом нормального функционирования иммунной системы [10–12]. Эти пробиотические бактерии оказывают не просто иммуностимулирующее, а иммуномодулирующее действие, по-разному влияя на здоровых и больных людей [13, 14].

Несмотря на сложный процесс взаимодействия между микрофлорой и организмом хозяина (состав бифидобактерий и лактобацилл у каждого человека в принципе уникален) [15], у больных с воспалительными процессами различной локализации пробиотики, содержащие эти микроорганизмы, модулируют иммунный ответ [16].

Бифидобактерии и лактобациллы влияют как на клеточное, так и на гуморальное звено иммунитета. Например, прием бифидумбактерина восстанавливает ранее сниженное содержание Т-хелперов, Т-супрессоров и их субпопуляций (CD₂, CD₄, CD₈, CD₁₉), а также соотношение Т-хелперов и Т-супрессоров, но не влияет на исходно нормальное количество иммунокомпетентных клеток [13]. Лактобациллы способны значительно усиливать цитотоксическую активность NK-клеток (natural killer – естественные киллеры) [17]. Bifidobacterium bifidum активирует фагоцитоз, причем это действие сохраняется в течение шести недель по окончании его введения [18, 19]. Так, в исследовании, проведенном в 2010 г., было установлено, что прием Lactobacillus (L) GG снижает риск возникновения инфекции верхних отделов респираторного тракта у детей, посещающих детский сад. Прием LGG был рекомендован для профилактики возникновения инфекции верхних отделов респираторного тракта у детей [20].

Данные микроорганизмы являются адъювантами гуморального иммунного ответа, поскольку способствуют нарастанию общего количества сывороточного Ig и специфического IgA к бактериальным возбудителям [21]. Кроме того, лактобациллы способствуют интенсивной продукции интерферонов, особенно интерферона альфа, которая начинается со вторых суток от момента введения пробиотика и продолжается две – четыре недели и более [17, 22].

Различные виды лактобацилл, в том числе L. plantarum, увеличивают синтез моноцитами периферической крови таких цитокинов, как фактор некроза опухоли альфа (ФНО-альфа), интерлейкин (ИЛ) 6, 10 и 12. Причем по активности они превосходят липополисахариды, являющиеся основной частью бактериальных эндотоксинов, что свидетельствует о стимуляции ими неспецифического клеточного иммунитета [23, 24]. В исследовании, проведенном в 2001 г., получены данные о том, что прием LGG снижает риск возникновения инфекции респираторного тракта у детей и необходимость назначения антибиотиков при осложнениях этих инфекций [25].

Пероральный способ введения пробиотиков и колонизация бифидобактериями и лактобациллами преимущественно толстого кишечника не ограничивают их влияние на иммунитет лишь иммунокомпетентными клетками ЖКТ [19]. Так, бифидобактерии и различные виды лактобацилл, включая L. plantarum, взаимодействуя с М-клетками пейеровых бляшек и эпителиальными клетками в кишечнике, способны индуцировать специфический иммунный ответ на различные антигены. При этом повышается содержание В-лимфоцитов и титров продуцируемых ими антител класса IgA в слизистой оболочке дыхательных путей [26, 27].

Таким образом, механизм иммуномодулирующего действия бифидо- и лактофлоры, по мнению большинства авторов, обусловлен усилением активности клеток моноцитарно-макрофагального ряда, NK-клеток, процессов фагоцитоза, увеличением продукции сывороточных Ig, интерферонов альфа и гамма, стимуляции Т-лимфоцитов. Клеточная стенка этих бактерий содержит мурамилдипептид, который активирует лимфопролиферативный ответ на Т- и В-клеточные митогены, стимулирует генерацию цитотоксических Т-лимфоцитов и продукцию Ig. Мурамилдипептид усиливает цитотоксичность естественных киллеров и макрофагов, стимулирует синтез ИЛ-1 и -6, ФНО-альфа и прочих цитокинов [28].

Для коррекции указанных особенностей иммунной системы у детей раннего возраста и негативного воздействия на иммунитет ротавирусов наряду с пробиотиками целесообразно использовать препараты интерферона, которые оказывают иммуномодулирующее и противовирусное действие, положительно влияют на динамику клинических проявлений заболевания [29]. Одним из широко применяемых препаратов данной группы считается человеческий рекомбинантный интерферон альфа-2b в виде ректальных суппозиториев.

Целью настоящей работы стало определение особенностей иммунного статуса и эффективности иммунотерапии при ротавирусной инфекции у детей.

Материал и методы исследования

Работа проводилась на базе 4-го инфекционного отделения ГБУЗ «Тушинская детская городская больница». Обследовано 145 детей в возрасте от пяти месяцев до 14 лет с ОКИ, протекающими по типу водянистой диареи. Среди них 10,3% – дети до одного года, 29% – в возрасте от одного до трех лет, 60,7% – старше трех лет; 74 (51%) мальчика и 71 (49%) девочка. Пациенты были госпитализированы в 1–2-е сутки от начала заболевания. В анамнезе у них отсутствовали пищевая аллергия, лактазная недостаточность, а также прием непосредственно перед настоящим эпизодом ОКИ пробиотиков и иммуномодуляторов.

Всем детям проводили общеклиническое обследование, включавшее сбор жалоб и анамнеза, осмотр в динамике, анализ крови и мочи, биохимический анализ крови, бактериологический посев кала на кишечную группу, копрограмму, по показаниям – ультразвуковое исследование органов брюшной полости, консультацию хирурга для исключения «острого живота». Кроме того, у всех пациентов для этиологической расшифровки заболевания с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) определяли антиген ротавируса в кале на базе бактериологической лаборатории Тушинской детской городской больницы, а также РНК рота-, норо- и астровирусов в копрофильтратах методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) на базе ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» РАМН.

Иммунологическое обследование всем детям проводили на 1–2-й и 5–6-й день госпитализации с целью динамического мониторинга за состоянием иммунного статуса. Исследования выполнялись на базе лаборатории онтогенеза и коррекции системы интерфероногенеза ГУ «НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи» РАМН и Центра иммунокоррекции ФГБУ «Федеральный научный центр трансплантологии и искусственных органов им. академика В.И. Шумакова» Минздрава России.

В сыворотке крови больных методом ИФА с помощью тест-систем производства Biosourse (Бельгия) и «Протеиновый контур» (Санкт-Петербург, Россия) определяли содержание провоспалительных цитокинов (ИЛ-1-бета, -6, -8, ФНО-альфа, интерферонов альфа и гамма) и способность in vitro к продукции иммунокомпетентными клетками интерферонов альфа и гамма. Исследовали также параметры фагоцитарной активности нейтрофилов (фагоцитарное число и фагоцитарный индекс) по методу Р.В. Петрова с использованием убитой взвеси Staphylococcus aureus, уровень общих иммуноглобулинов A, M, G в сыворотке крови по методу G. Manchini и концентрацию IgA_s в копрофильтратах методом радиальной иммунодиффузии.

Все пациенты получали стандартное лечение пероральными регидратационными растворами, энтеросорбентами, ферментными препаратами в возрастных дозах. При необходимости проводили инфузионную терапию глюкозосолевыми растворами, назначали жаропонижающие средства. Дополнительно к базисному лечению 33 ребенка первой группы получали пробиотик Бифиформ^® Малыш, содержащий штаммы ВВ12 и LGG, в возрастных дозах в течение пяти дней. 34 детям второй группы вводили ректально интерферон альфа-2b (Виферон^®, «Ферон») по одному суппозиторию дважды в сутки, курс пять дней (в возрасте до семи лет по 150 000 МЕ, старше семи лет – по 500 000 МЕ). 35 пациентов третьей группы получали комбинированное лечение препаратами Бифиформ^® Малыш и интерферон альфа-2b (Виферон^®, «Ферон»). 43 ребенка контрольной (четвертой) группы получали только базисную терапию. Группы формировались методом случайной выборки и были сопоставимы по возрасту, степени тяжести заболевания, типу диареи и топике поражения ЖКТ.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ Statistica 6.1 с использованием параметрического t-критерия Стьюдента и непараметрических критериев Вилкоксона, Уитни – Манна и Фишера.

Результаты и их обсуждение

Этиологию ОКИ удалось установить у 81,4% больных. В частности, у 53,8% причиной заболевания стал ротавирус, у 9,7% – норовирус, у 3,4% – астровирус, у 9,7% – микст-вирусная инфекция, у 4,8% – сальмонеллез. Диарея осмотического типа встречалась у 109 (75,2%) пациентов, секреторного – у 13 (8,9%), инвазивного – у 12 (8,3%) больных. У 11 (7,6%) детей заболевание протекало без диареи. По топике поражения ЖКТ чаще регистрировался гастроэнтерит – 76,6%.

ОКИ протекала в легкой форме у девяти (6,2%) больных, в среднетяжелой – у 119 (82,1%), в тяжелой – у 17 (11,7%) детей. Длительность лихорадки оказалась достоверно менее продолжительной при легком течении заболевания по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми формами – 1,22 ± 0,83, 2,32 ± 1,18 и 3,17 ± 1,07 суток соответственно (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента). Рвота также была менее продолжительной у больных с легким течением относительно пациентов с тяжелым течением ОКИ – 1,22 ± 0,66 против 2,05 ± 0,96 суток (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента). Диарея длилась достоверно меньше при легких формах заболевания по сравнению со среднетяжелыми и тяжелыми – 2,0 ± 1,0, 3,68 ± 1,62 и 4,64 ± 1,27 суток соответственно (р < 0,01 по t-критерию Стьюдента). Метеоризм наблюдался при осмотическом типе диареи у 85,3% детей, при секреторном – у 69,2%, при инвазивном – у 75,0%. В отсутствие диарейного синдрома метеоризм встречался лишь у 27,7% больных.

Токсикоз с эксикозом различной степени развивался у 79,8% детей с осмотической диареей, у 76,9% – с секреторной, у 83,3% – с инвазивной и у 54,6% пациентов – без диареи. В зависимости от топики поражения ЖКТ токсикоз с эксикозом чаще (в 75–80% случаев) отмечался при гастроэнтеритах, энтероколитах и гастроэнтероколитах, тогда как при гастритах обезвоживание наблюдалось реже (55% случаев). В целом длительность эпизода ОКИ при легком течении составила 3,55 ± 0,72 суток, что достоверно короче относительно среднетяжелых и тяжелых форм – 5,18 ± 1,3 и 6,23 ± 1,09 суток соответственно (р < 0,001 по t-критерию Стьюдента). Среди всех клинических форм достоверно менее продолжительным оказалось течение гастрита (3,8 ± 0,6 суток) по сравнению с другими топическими диагнозами – гастроэнтеритом, энтероколитом и гастроэнтероколитом – 5,2 ± 1,3, 6,0 ± 2,0 и 5,7 ± 1,1 суток соответственно (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента).

Результаты проведенных иммунологических исследований показали, что в острый период ОКИ независимо от типа диареи в сыворотке крови у 70,6% больных снижался уровень IgA в среднем до 0,71 ± 0,45 г/л при норме 0,93 ± 0,3 г/л и у 94,1% пациентов повышался уровень IgМ в среднем до 1,3 ± 0,74 г/л при норме 0,56 ± 0,2 г/л. Содержание IgG у 94,1% детей оставалось в пределах нормы – в среднем 8,55 ± 2,99 г/л. Указанные изменения свидетельствовали об активации гуморального звена иммунитета в острый период заболевания в ответ на антигенную стимуляцию. В период ранней реконвалесценции у всех пациентов наблюдалось спонтанное повышение в сыворотке крови концентрации IgA в среднем до 1,09 ± 0,63 г/л при сохранении высокой концентрации IgМ и нормальной концентрации IgG (табл. 1). Эти изменения коррелировали со снижением уровня IgAs в копрофильтратах с 0,58 до 0,42 мг/мл, что отражало процесс купирования местной воспалительной реакции в кишечнике на фоне формирования гуморального иммунного ответа.

У 77,8% детей выявлено снижение фагоцитарного индекса в среднем до 40% при норме 50–70% и снижение фагоцитарного числа до 3 микробных тел при норме 4–7 – у 100% больных. При ротавирусной инфекции дефицит фагоцитоза коррелирует со слабой системной продукцией интерферонов альфа и гамма, что обусловлено, вероятно, иммуносупрессивным действием ротавируса в острый период заболевания [30]. В динамике у 72,8% пациентов фагоцитарный индекс в среднем достигал нижних значений нормы (49,5%), тогда как фагоцитарное число сохранялось на низком уровне – 3,1 (табл. 1). Подобные изменения свидетельствовали о дефиците клеточного звена иммунитета.

При исследовании цитокинового статуса анализировали продукцию провоспалительных ИЛ-1-бета, -6, -8, ФНО-альфа, являющихся медиаторами клеточного звена иммунитета, а также спонтанных и индуцированных интерферонов. В острый период ротавирусной инфекции отмечалось повышение содержания в сыворотке крови ИЛ-1-бета и ИЛ-6 до 272,18 и 86,9 пкг/мл соответственно. Содержание ИЛ-8 и ФНО-альфа не превышало 27,7 и 32,0 пкг/мл соответственно (норма для всех показателей до 50 пкг/мл). В период ранней реконвалесценции наблюдалось отсутствие существенной динамики в уровне ФНО-альфа, ИЛ-6, -8, тогда как уровень ИЛ-1-бета достоверно возрастал по сравнению с острым периодом заболевания и достигал 357,85 пкг/мл (табл. 2), что отражало степень местной воспалительной реакции в ЖКТ и активацию антителообразования.

В течение 1–2-х суток заболевания количество сывороточных интерферонов альфа и гамма сохранялось в пределах нормы (19,05 и 12,0 пкг/мл соответственно при норме до 50 пкг/мл). Индуцированная продукция интерферонов альфа и гамма снижалась до 63,45 и 508,2 пкг/мл соответственно (норма 100–500 и 1000–5000 пкг/мл), что свидетельствовало о недостаточности противовирусного иммунитета в ответ на нагрузку антигенами ротавируса [31]. При динамическом исследовании существенных изменений количества данных цитокинов не наблюдалось: уровень сывороточных интерферонов альфа и гамма не превышал нормальных значений, а их индуцированная продукция оставалась сниженной у 75,2 и 80,4% детей соответственно. Такое сохранение в период ранней реконвалесценции дефицита индуцированной продукции интерферонов альфа и гамма говорило о снижении возможностей интерфероногенеза и длительности иммуносупрессии.

Поскольку наиболее выраженные нарушения из всех изучаемых иммунологических показателей отмечались со стороны ИЛ-1-бета, нами была проанализирована клиническая картина ротавирусной инфекции у детей в зависимости от уровня этого цитокина (табл. 3). Достоверно чаще у больных с высоким уровнем ИЛ-1-бета наблюдалась рвота 6–10 раз в сутки и токсикоз с эксикозом II степени – 30 против 11,6% и 30 против 9,3% соответственно (р < 0,05 по критерию Фишера), что позволяло рассматривать данный цитокин в качестве маркера синдрома интоксикации в острый период ротавирусной инфекции. Это подтверждало и то обстоятельство, что высокий уровень ИЛ-1-бета выявлен у пациентов всех возрастных групп при любом течении заболевания. Однако степень его повышения при этом была разной. Так, у детей в возрасте старше семи лет диапазон количества ИЛ-1-бета в сыворотке крови был значительно шире, чем у детей младшего возраста, и колебался в пределах 123–2073 пкг/мл. При легком течении ротавирусной инфекции уровень данного цитокина в 2–4 раза превышал норму (в среднем 201,56 пкг/мл), при среднетяжелом течении – в 4–6 раз (в среднем 304,27 пкг/мл), при тяжелом – в 6–8 раз (в среднем 406,97 пкг/мл).

Выявленные отклонения в цитокиновом статусе у детей с ротавирусной инфекцией стали основанием для включения иммунотерапии в комплекс лечебных мероприятий при данной нозологии. У детей первой группы достоверных различий в выраженности и длительности различных симптомов заболевания не наблюдалось, но отмечалось положительное влияние этого пробиотика на показатели иммунитета: достоверно повышались фагоцитарный индекс, фагоцитарное число и уровень сывороточного IgA (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента). Уровень IgМ в сыворотке крови хотя и оставался повышенным, но был достоверно ниже аналогичного показателя в контрольной группе.

У пациентов второй группы достоверно быстрее купировались симптомы интоксикации по сравнению с пациентами четвертой (контрольной) группы (р < 0,05 по t-критерию Стьюдента). При этом в два раза нарастало содержание интерферонов альфа и гамма у 37,5 и 46,1% больных соответственно, что превосходило показатели контрольной группы. Но эти различия не были достоверны, что объясняется низкой интерфероногенной активностью ротавируса в острый период заболевания [31].

У детей третьей группы, получавших наряду с базисным лечением Бифиформ^® Малыш и интерферон альфа-2b, как и во второй группе, зарегистрировано достоверное сокращение симптомов интоксикации относительно контроля, а также положительная динамика иммунологических показателей: снижение уровня провоспалительного цитокина – ИЛ-6 – и повышение содержания интерферона гамма, индуцированного до нормы, у 66,7% пациентов по сравнению с пациентами четвертой группы (р < 0,001 по t-критерию Стьюдента).

Длительность заболевания во всех группах составила в среднем пять суток. Таким образом, ни один из изучаемых способов лечения на продолжительность ротавирусной инфекции у детей существенно не повлиял. Однако, несмотря на клиническое выздоровление к этому сроку, полной нормализации показателей клеточно-опосредованного противовирусного иммунитета и интерфероногенеза не произошло. Катамнестическое наблюдение в течение шести месяцев 74 пациентов, перенесших ротавирусную инфекцию, показало, что дети, получавшие в острый период интерферон альфа-2b и комбинацию интерферона альфа-2b и Бифиформ^® Малыш, в отличие от пациентов, находившихся на базисной терапии или лечившихся по стандарту в сочетании с пробиотиком, в 1,5 раза реже болели острыми респираторными вирусными инфекциями (ОРВИ) (рисунок). При этом заболевание у них протекало в легкой и среднетяжелой форме – 53,2 и 46,8% соответственно.

Выводы

Острый период ОКИ независимо от типа диареи характеризуется активацией гуморального звена иммунитета в ответ на антигенную стимуляцию, что выражается в снижении уровня сывороточного IgA и повышении IgМ, а также дефицитом клеточного звена иммунитета, проявляющимся снижением показателей фагоцитоза.

В период ранней реконвалесценции ОКИ при повышении в сыворотке крови концентрации IgA и сохранении высокой концентрации IgМ снижается уровень IgAs в копрофильтрате, что свидетельствует о купировании местной воспалительной реакции в кишечнике на фоне формирования адекватного иммунного ответа.

Иммуносупрессивное действие ротавируса подтверждается снижением индуцированной продукции интерферонов альфа и гамма на протяжении всего течения инфекции, что служит обоснованием включения иммунотерапии в комплекс терапевтических мероприятий у больных ротавирусной инфекцией.

Применение у пациентов пробиотика Бифиформ^® Малыш, содержащего LGG и ВВ-12, способствует положительной клинико-иммунологической динамике в острый период заболевания и может быть рекомендовано в комплексном лечении ротавирусной инфекции.