Молекулярные факторы опухолевой прогрессии при увеальной меланоме

Таблица 1. Характеристика праймеров и условий ПЦР-ПДРФ-анализа

Рис. 1. Примеры анализа полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в 10%-ном полиакриламидном геле: Н2О – отрицательный контроль (dd вода), К+ – образец до обработки рестриктазой, M – Lad 50 – маркер с шагом полос 50 п.н.

Таблица 2. Результаты исследования мутаций генов GNAQ и GNA11 в увеальных меланомах

Рис. 2. Примеры анализа мутаций в экзонах 4 и 5 генов GNA11 и GNAQ. Электрофоретическое разделение в 2%-ном агарозном геле продуктов ПЦР-ПДРФ для образцов ДНК меланомы. К+ – образец до обработки рестриктазой, M1 – pUC19/MspI, M2 – Lad 50 – маркер с шагом

Таблица 3. Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 среди больных увеальной меланомой

Рис. 3. Корреляция частот генотипов СТ и СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии увеальной меланомы

Введение

Злокачественные внутриглазные опухоли меланоцитарного генеза представляют угрозу не только для зрения, но и для жизни пациента. Их частота достигает 15% общего числа меланом других локализаций. При этом частота увеальной меланомы (УМ) составляет 85–88% всех первичных внутриглазных злокачественных новообразований [1].

В России заболеваемость УМ колеблется от 6,23 до 8 человек на 1 млн взрослого населения в год [1]. В педиатрической популяции данный показатель значительно ниже [2].

УМ характеризуется агрессивным, прогрессирующим течением, высокой вероятностью метастазирования и летального исхода. Через пять лет у 50% пациентов с УМ после проведенного лечения диагностируют метастазы в печени [3, 4].

Поиску факторов прогноза течения опухолевого процесса при УМ в последние годы придается особое значение. Первыми были изучены клинические факторы. К ним относятся пол, возраст, расовая принадлежность, иммунологический статус, общий статус больного, сопутствующие заболевания, локализация и размеры опухоли [5, 6]. К сожалению, на текущий момент взаимосвязь многих из перечисленных факторов с УМ изучена недостаточно. Более чувствительны патоморфологические факторы: тип гистологического строения опухоли, степень инвазии склеры, прорастание за пределы фиброзной капсулы, характер и тип ангиогенеза, степень лимфоидной инфильтрации в строме опухоли, уровень пролиферативной активности клеток новообразования, размеры ядра и ядрышкового анализатора и т.д. [7].

Выявление молекулярно-генетических изменений при УМ представляется наиболее перспективным способом прогнозирования течения заболевания. На сегодняшний день накоплен большой опыт в изучении цитогенетических изменений при УМ [8–9, 11]. К наиболее характерным хромосомным перестройкам и нарушениям численности отдельных хромосом можно отнести потерю одной копии хромосомы 3 (моносомия 3), что коррелирует с увеличением размера опухоли, вовлеченностью цилиарного тела, наличием в опухоли эпителиоидных клеток, полей оранжевого пигмента на поверхности опухоли, а также наличием замкнутых сосудистых петель [8–11].

В УМ удалось выявить мутации онкогенов, характерные для кожных меланом, однако частота их встречаемости невелика. Например, мутации BRAF при УМ обнаруживают в 13% случаев. При кожных меланомах частота данных мутаций достигает 90% [12]. В последние годы выявлена мутация новых онкогенов GNAQ и GNA11 в ряде опухолевых процессов органа зрения. Частота обнаружения мутации при УМ, по данным разных авторов, – 46–90% [13–15]. Роль полиморфизма гена ABCB1 при УМ изучена в единичных работах [16, 17].

Целью исследования стал анализ мутаций в онкогенах GNAQ и GNA11 и полиморфизма гена ABCB1/MDR1, их корреляции с клиническими и морфологическими характеристиками при первичной УМ.

Материал и методы исследования

Всего обследовано 30 пациентов (12 мужчин и 18 женщин, соотношение 2:3) в возрасте от 23 до 72 лет (средний возраст 52,5 ± 9,1 года). Высота опухоли – от 2,6 до 13,8 мм (9,05 ± 3,8 мм), диаметр основания опухоли – от 8,2 до 21,9 мм (15,4 ± 5,6 мм). Объектом изучения стали опухоли цилиохориоидальной области (n = 5 (16,7%)), хориоидеи (n = 22 (73,3%)) и иридоцилиохориоидальной области (n = 3 (10%)).

Из исследования были исключены больные с обострением хронических воспалительных процессов, аутоиммунными, наследственными и психическими заболеваниями. В качестве популяционного контроля при анализе полиморфизма гена ABCB1 использовали сопоставимую по половозрастным характеристикам выборку онкологически здоровых индивидуумов (n = 60).

Исследованы препараты ДНК, выделенные из образцов УМ, полученных при энуклеации пораженного глаза. Гистологическая верификация опухоли проведена в отделе патологической анатомии и гистологии Московского НИИ глазных болезней им. Гельмгольца. По гистологическому строению выделяли опухоли веретеноклеточного типа – 16 (53,3%) пациентов, смешанно-клеточного – девять (30%) и эпителиоидно-клеточного – пять (16,7%) больных. ДНК из образцов свежезамороженной опухолевой ткани выделяли методом фенол-хлороформной экстракции. Выделенные образцы ДНК хранились при температуре -20 ^оС.

Для выявления мутации в генах GNAQ и GNA11 использовали метод определения полиморфизма длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ, RFLP – restriction fragment length polymorphism). Нуклеотидные последовательности праймеров приведены в табл. 1. Идентификация аллелей полиморфного маркера C3435T (rs1045642) гена АBСB1 также осуществлялась на основании анализа ПЦР-ПДРФ. Для ПЦР использовали следующие олигонуклеотиды: ABCB-3435-F 5`-aggtttcacatcaccaagattcc-3` и ABCB-3435-R 5`- TTCTCAGAAAGGAGTA­TGCC­TTA-3`. ПЦР проводили в 25 мкл реакционной смеси, содержащей 60 мМ Трис-HCl, рН 8,9, 10 мМ 2-меркаптоэтанол, 25 мМ КСl, 0,1%-ный Тритон Х-100; 0,25 мМ каждого dNTP; 1–10 нг ДНК; 25 пмолей каждого праймера; 2,0 ед Taq-полимеразы («СибЭнзим»); MgCl₂ в концентрации 2,0 мM. Амплификацию (на амплификаторe Терцик, Россия) выполняли по следующей программе: 95 °С, 1 минута 30 секунд; 35 циклов 92 °С, 15 cекунд; 60 °С, 20 секунд; 72 °С, 15 секунд; 72 °С, 1 минута 30 секунд. Далее амплифицированный фрагмент ДНК подвергали обработке соответствующей рестриктазой (табл. 1). Полноту расщепления ДНК рестриктазами проверяли путем расщепления 1 мкг фага лямбда за один час. Для продукта амплификации использовали трехкратное количество фермента.

Амплифицированный фрагмент ДНК гена АBСB1 подвергали обработке с использованием рестриктазы PctI («СибЭнзим») в термостате при температуре 50 °С в течение 16 часов. При наличии мутантного ТТ-генотипа амплифицируемый в ходе ПЦР фрагмент гена АBСB1 размером 206 п.н. гидролизуется рестриктазой PctI на два фрагмента – 143 и 63 п.н. В гетерозиготном генотипе гена АBСB1-СТ присутствуют все три фрагмента.

Результаты ПДРФ анализировали электрофоретически в 10%-ном полиакриламидном геле с добавлением бромистого этидия (0,5 мкг/мл) и визуализацией в проходящем ультрафиолетовом свете (рис. 1).

Статистический анализ проводили с использованием точного критерия Фишера. Расчеты осуществлялись в пакетах программ для Windows (Microsoft Excel, Statistica 6.0 RUS).

Результаты и их обсуждение

При ПДРФ-анализе 30 препаратов УМ-мутации в генах GNAQ и GNA11 были выявлены у 27 (90%) из 30 обследованных пациентов (табл. 2). Мутации в 5-м экзоне (Gln209) в гене GNAQ обнаружены у пяти (16,7%) пациентов, в гене GNA11 – у половины (50%).

В 4-м экзоне (Arg183) гена GNAQ у 12 (40%) обследованных пациентов зафиксированы гомозиготные мутации. В 4-м экзоне (Arg183) гена GNA11 мутаций не найдено. В 93% случаев (в 25 из 27) мутации глутамина в 209-м положении и аргинина в 183-м положении в генах GNAQ и GNA11 взаимоисключающие, то есть наличие одной мутации исключает наличие другой, что согласуется с данными литературы [13–15]. Примеры анализа мутаций приведены на рис. 2. В то же время, согласно данным литературы, частота мутаций в 5-м экзоне (Gln209) генов GNAQ и GNA11 составляет 45 и 32% соответственно, в 4-м экзоне (Arg183) для обоих генов ≈ 6% [13–15].

У трех пациентов из 27 выявлены одновременно две мутации. В случае мутации в паре GNAQ (Gln209)/GNA11 (Gln209) опухоль имела цилиохориоидальную локализацию. В другом случае при выявлении мутации в паре GNAQ (Arg183)/GNAQ (Gln209) опухоль имела смешанно-клеточный тип строения, у пациента присутствовал отягощенный семейный анамнез по онкологическим заболеваниям. В третьем случае при наличии мутаций в паре GNAQ (Arg183)/GNA11 (Gln209) опухоль располагалась в хориоидее и имела смешанно-клеточный тип строения. В одном случае удалось выявить три мутации в генах GNAQ (Arg183)/GNAQ (Gln209)/GNA11 (Gln209). У данного пациента опухоль располагалась также в хориоидее и имела веретеноклеточный тип строения.

По данным литературы, статистически значимых ассоциаций между мутациями в генах GNAQ и GNA11 при первичной УМ и клиническими (пол, возраст, высота и диаметр основания опухоли, пигментация), цитогенетическими или молекулярными параметрами не зафиксировано [13–15].

Нами проведена оценка ассоциаций между мутациями в генах GNAQ и GNA11 и клиническими параметрами опухоли, такими как локализация, размеры образования, наличие пигментации, гемофтальма, отслойки сетчатки, субретинального экссудата, видимых собственных сосудов, полей оранжевого пигмента, экстрабульбарного роста, а также гистологическим типом опухоли и наличием отягощенного семейного анамнеза в отношении онкологической патологии у пациента. При этом удалось установить статистически значимую ассоциацию частоты мутации глутамина в 209-м положении гена GNAQ с высокой отслойкой сетчатки (4/11 против 1/19, p = 0,0472). В то же время с другими клиническими признаками значимых связей не зарегистрировано.

По данным C.D. Van Raamsdonk и соавт., мутации в генах GNAQ и GNA11 наиболее часто отмечаются в УМ эпителиоидно-клеточного и смешанно-клеточного типа по сравнению с веретеноклеточным типом. Однако подобная разница не носит статистически значимого характера [14]. В нашем исследовании частота мутации в экзоне 5 гена GNA11 в опухоли веретеноклеточного типа в 2,8 раза превышала таковую при эпителиоидно-клеточном типе (9/16 (56%) против 1/5 (20%)).

Учитывая, что веретеноклеточная УМ характеризуется более благоприятным течением по сравнению с эпителиоидно-клеточной и смешанно-клеточной, можно предположить, что выявление означенной мутации может свидетельствовать о более доброкачественном варианте течения УМ. Тем не менее данный вопрос сложный и многофакторный, требующий дальнейшего изучения.

Распределение частот аллелей и генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 в контрольной группе и группе больных УМ представлено в табл. 3. В 80% случаев выявлен аллель С, что свидетельствует о высокой специфичности данного аллеля для УМ. При этом в опытной группе аллель С встречался почти в два раза чаще, чем в контрольной (80 против 41,7%).

Показана достоверная ассоциация предрасполагающего генотипа СС-гена АBСB1 с риском развития УМ. Так, частота данного генотипа в группе больных оказалась в четыре раза выше, чем в группе контроля. Между тем генотип ТТ у больных не обнаружен. Ассоциация генотипа CТ с риском развития УМ отмечалась в 40% случаев от общего количества аллелей С. Вместе с тем данная ассоциация не была значимой (p > 0,05). Таким образом, можно предположить, что наличие аллеля С является неблагоприятным фактором при развитии УМ, в то время как аллель Т можно рассматривать как благоприятный фактор.

Корреляция частот генотипов СТ и СС полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 с параметрами прогрессии УМ представлена на рис. 3.

Выявлена значимая ассоциация генотипа СС полиморфного маркера C3435T гена ABCB1 со степенью пигментации опухоли (с выраженной пигментацией исследовано 13 случаев, со слабой – 14, без пигментации – три) (диаграмма А, рис. 3). Частоты генотипов СТ и СС при выраженной пигментации опухоли значительно не отличались друг от друга и составили 52 и 46% соответственно. В случае умеренно выраженной пигментации или в ее отсутствие частота генотипа СС более чем в два раза превышала таковую для генотипа СТ (71% (12/17) против 29% (5/17)).

В настоящее время нет единого мнения о роли пигментации в опухолевом процессе при УМ, но большинство исследователей сходятся во мнении, что именно беспигментные и малопигментированные опухоли прогностически наиболее неблагоприятны [5]. В связи с этим наши данные могут свидетельствовать о большей злокачественности опухолей с генотипом СС.

Анализ распределения частот генотипов СС и СТ в зависимости от высоты опухоли показан на диаграмме Б (рис. 3). Исследованные опухоли были разделены на две группы: < 10 мм (n = 18) и ≥ 10 мм (n = 12). При этом частота генотипов СС и СТ в первой группе была одинаковой – 50% (по девять глаз в каждой группе). Во второй группе отмечалось трехкратное увеличение частоты генотипа СС по сравнению с генотипом СТ (75 и 25% соответственно), что свидетельствует о важной роли предрасполагающего генотипа СС гена ABCB1 в прогрессии УМ.

Выявлена также значимая ассоциация частот генотипов СС и СТ с наличием видимых сосудов в опухоли (n = 23), что также принято считать относительно неблагоприятным прогностическим фактором (диаграмма В, рис. 3). При этом частота генотипа СС составила 65%, частота генотипа СТ – 35%. В семи случаях видимые собственные сосуды при офтальмоскопии не обнаружены, при этом частота генотипов СС и СТ отличалась незначительно – 42 и 58% соответственно.

При оценке ассоциации генотипов гена ABCB1 с различными гистологическими типами опухолей, такими как прогностически благоприятный веретеноклеточный (n = 16), менее благоприятный смешанно-клеточный (n = 9) и неблагоприятный эпителиоидно-клеточный (n = 5), смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный типы были объединены в одну группу (диаграмма Г, рис. 3). Частота генотипов СС и СТ при веретеноклеточном типе опухоли не различалась – по 50% (по восемь глаз в каждой группе). В случае смешанно-клеточного типа опухоли частота генотипа СТ достигла 33% (три глаза). Частота генотипа СС была в два раза больше – 66% (шесть глаз). При эпителиоидно-клеточном типе опухоли разница была еще заметнее: частота генотипа СТ – 20% (один глаз), частота генотипа СС – 80% (четыре глаза). В объединенной группе с эпителиоидно-клеточным и смешанно-клеточным типом опухоли частота генотипа СТ составила 30%, генотипа СС – 70%.

Таким образом, показана неблагоприятная прогностическая значимость генотипа СС гена ABCB1 для развития УМ.

В одной из работ продемонстрирована возможность выявления данных полиморфизмов в периферической крови, что в перспективе можно рассматривать в качестве потенциального скрининга по УМ для пациентов, входящих в группу риска по данному заболеванию, а также прогнозирования течения заболевания [18].

Заключение

В настоящей работе изучено распределение частот генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 и мутаций в онкогенах GNAQ и GNA11 с риском развития УМ и их связь с клинико-патоморфологическими параметрами УМ. Показана связь частоты мутаций в гене GNA11 с гистологическим типом опухоли. Выявлена ассоциация мутации в гене GNAQ с высокой отслойкой сетчатки. Определена статистически значимая ассоциация генотипа СС и ряда клинических (умеренная пигментация опухоли, высота опухоли и наличие видимых собственных сосудов) и патоморфологических (смешанно-клеточный и эпителиоидно-клеточный тип опухоли) факторов. В то же время наличие аллеля Т гена АBСB1, безусловно, свидетельствует об относительно благоприятном течении опухолевого процесса.

Полученные нами данные могут свидетельствовать о значимости генотипов полиморфного маркера C3435T гена АBСB1 и онкогенов GNAQ и GNA11 в развитии УМ и их патогномоничности для этой патологии. Выявленные особенности могли бы быть использованы для разработки в ходе дальнейших исследований современных подходов к прогнозированию течения УМ, а также для скрининга пациентов, входящих в группу риска по данному заболеванию.