Результаты неоадъювантной химиотерапии рака молочной железы в сочетании с перитуморальным применением фактора некроза опухоли – тимозина альфа-1

Таблица 1. Непосредственный противоопухолевый эффект неоадъювантного лечения больных

Рис. 1. Морфологические изменения в опухоли после неоадъювантной ХТ с перитуморальным применением рекомбинантного ФНО-Т: обширные поля петрификатов (А), очаговая лимфоплазмоцитарная инфильтрация (Б, В), дистрофические изменения раковых клеток (Г, Д)

Рис. 2. Степень терапевтического патоморфоза опухоли после курсов неоадъювантной ХТ

Рис. 3. Внутриопухолевая микрососудистая плотность в трепанбиоптатах и операционном материале

Таблица 2. Уровень VEGF, EGFR в ткани опухоли на фоне лечения

Рис. 4. Иммуногистохимические изменения в ткани опухоли молочной железы после трех циклов ХТ с рекомбинантным ФНО-Т (операционный материал). Окрашивание на CD34 (А), CD31 (Б), EGFR (В), VEGF (Г) (400-кратное увеличение)

Рис. 5. Лимфоидная инфильтрация в ткани опухоли после трех циклов неоадъювантной ХТ и ФНО-Т (CD3 – немногочисленные лимфоциты (А), CD4 – очаговая лимфоидная инфильтрация (Б), CD8 – очаговая лимфоцитарная инфильтрация (В), CD20 – немногочисленные лимфоцит

Введение

В структуре заболеваемости злокачественными новообразованиями женского населения как России, так и большинства других стран мира лидирует рак молочной железы (РМЖ). Особое место занимают исходно неоперабельные местно-распространенные формы РМЖ, прогноз которых хуже, чем ранних, операбельных форм заболевания [1]. В России 24,3% всех случаев впервые диагностированного РМЖ составляют местно-распространенные формы, когда выполнение радикальной операции невозможно без предварительного системного лечения, направленного на уменьшение размеров опухоли [2]. В настоящее время таксаны и антибиотики антрациклинового ряда считаются золотым стандартом в предоперационной терапии РМЖ [3].

Одним из современных направлений развития онкологии является изучение роли цитокиновых препаратов в лечении злокачественных новообразований, в том числе РМЖ [4]. Если в основу химиотерапии изначально заложено токсическое воздействие на здоровые и больные клетки, то при иммунотерапии эффект достигается посредством активации собственных защитных механизмов организма. Сочетание химиотерапии с иммунотропными веществами способно значительно снижать токсический и иммуносупрессивный эффект цитостатиков [5]. В этом аспекте интерес представляет рекомбинантный фактор некроза опухоли – тимозин альфа-1 (ФНО-Т) – гибридная молекула двух биологически активных агентов – цитокина фактора некроза опухоли и гормона тимозина. Препарат обладает прямым противоопухолевым действием in vitro и in vivo на различных линиях опухолевых клеток, угнетает ангиогенез в противоположность ФНО-альфа, повышает проницаемость эндотелия сосудов, запускает процесс апоптоза опухолевых клеток, а также активирует каскад химических реакций коагуляционной системы крови [6]. Возможно усиление противоопухолевой эффективности цитостатиков при проведении комплексной терапии с ФНО-альфа [7]. Благодаря входящему в состав ФНО-Т тимозину альфа-1 препарат способен оказывать стимулирующее воздействие на Т-клеточное звено иммунной системы, наиболее значимое для противоопухолевого иммунитета, а также участвует в реакциях гуморального иммунитета [6].

Не вызывает сомнений важность неоангиогенеза в развитии раковых опухолей. Экспрессия фактора роста эндотелия сосудов в злокачественных опухолях молочной железы связана с неблагоприятным прогнозом [8], а подавление ангиогенеза ведет к торможению опухолевого роста и развития метастазов. Как известно, развитие и рост злокачественной опухоли обусловлены ее способностью продуцировать ангиогенные факторы, стимулирующие неоваскуляризацию [9]. В ряде исследований были получены морфологические доказательства эффективности аутобиотерапии (аутогемо- и ауто­плазмохимиотерапии) с помощью определения микрососудистой плотности раковой опухоли молочной железы [10, 11]. В настоящее время представляет интерес изучение новых препаратов, способных влиять на неоангиогенез в опухоли и локальный противоопухолевый иммунитет.

Вместо стандартного подкожного метода введения препарата нами было предложено вводить рекомбинантный ФНО-Т перитуморально. Проанализировав механизмы действия препарата, мы предполагали получить более выраженный эффект за счет максимального воздействия непосредственно на зону опухоли и перитуморальной ткани.

Материал и методы исследования

Основные критерии включения больных в исследование: гистологически верифицированный РМЖ, степень распространения онкологического процесса T14N02M0, удовлетворительная функция печени, почек, костного мозга, отсутствие отдаленных метастазов, ECOG ≤ 1, возраст старше 18 лет. В исследовании участвовали 82 больных в возрасте от 29 до 69 лет (средний возраст – 53,3 ± 1,1 года). Существенных различий в возрасте, степени распространения заболевания, спектре сопутствующей патологии, гистологическом и иммуногистохимическом типе не наблюдалось. У 41,8% пациенток менструальная функция была сохранной, у 61,2% наступила менопауза. Люминальный В (HER2+/-) тип РМЖ наблюдался в 61,6% случаев, HER2-гипер­экспрессирующий тип – в 24,8%, тройной негативный и люминальный А типы РМЖ – в 9,8%.

Пациентки были рандомизированы на две группы – основную и контрольную. В основную вошли 30 пациенток, которым ФНО-Т вводили перитуморально по 200 000 МЕ в первые сутки (за 30 минут до введения цитостатиков) и далее один раз в день на вторые – пятые сутки каждого цикла химиотерапии (ХТ). Для нео­адъювантной ХТ в обеих группах применяли режимы FAC (5-фторурацил 500 мг/м², доксорубицин 50 мг/м², циклофосфан 500 мг/м², интервал 21 день) или РА (паклитаксел 175 мг/м², доксорубицин 50 мг/м², интервал 21 день).

Непосредственный противоопухолевый эффект оценивали по критериям RECIST 1.0, побочные токсичные эффекты ХТ – по критериям CТC АЕ 3.0.

Для оценки ангиогенеза в опухолях использовали индекс внутриопухолевой микрососудистой плотности (intratumor microvessel density – MVD), который позволяет количественно оценить процесс ангиогенеза в опухоли и определяется стандартным иммуногистохимическим методом с использованием эндотелиальных антител. Микрососуды окрашивали антителами CD34, CD31, VEGF (vascular endothelial growth factor) и EGFR (epidermal growth factor receptor). Количество сосудов определяли в каждом поле зрения препарата.

CD34 является общим эндотелиальным маркером и предоставляет информацию обо всех сосудах в ткани опухоли – предсуществующих и новообразованных [12]. CD31 – член семейства молекул адгезии поверхностных гликопротеинов, вовлеченный в межклеточные взаимодействия, процессы эмбриогенеза и развития тканей. Маркеры CD34 и CD31 традиционно используются для выявления именно кровеносных сосудов и оценки их плотности в ткани [13].

Среди разнообразных специфических и неспецифических регуляторов ангиогенеза ведущая роль, безусловно, принадлежит VEGF – фактору роста эндотелия сосудов. Он стимулирует неоангиогенез в опухолях, участвует в поддержании микрососудистой сети опухоли, препятствуя апоптозу незрелых эндотелиоцитов, тормозит нормальный ответ на опухоль иммунной системы, подавляя созревание дендритных клеток. Для сравнения использовали гистологический материал, полученный при трепанбиопсии опухоли до лечения, и послеоперационный материал.

Статистическую обработку данных проводили с использованием пакета программ Statistica 10.0.

Результаты и их обсуждение

Результаты непосредственного противоопухолевого эффекта проводимой терапии представлены в табл. 1.

Процент достижения объективного ответа в виде частичного и полного регресса опухоли и лимфоузлов в основной группе был выше, чем в контрольной, – 80 против 71,7 (p < 0,05). Достижение полного регресса опухоли в основной группе достигалось в 2,2 раза чаще, чем в контрольной (16,6 и 7,7% соответственно, p < 0,05). У 5,8% пациенток контрольной группы на фоне неоадъювантного лечения отмечалось прогрессирование злокачественного процесса, что не позволило провести хирургическое вмешательство. Случаев прогрессирования заболевания в основной группе не наблюдалось, что было подтверждено рентгенологически [14].

В основной группе удалось добиться операбельного состояния у всех больных, применив не более четырех курсов неоадъювантной ХТ в комбинации с рекомбинантным ФНО-Т. В то же время 24% пациенток контрольной группы потребовалась более длительная неоадъювантная ХТ – до пяти-шести курсов. Достоверных различий по имеющимся осложнениям после проведенной ХТ в группах не выявлено.

В основной и контрольной группах зарегистрированы побочные эффекты низкой и средней степени выраженности. Из клинически значимых осложнений чаще отмечались нейтропения 2–3-й степени – 18–20% циклов, анемия 1–2-й степени – 4%, диспепсия 1–2-й степени – 26–27%, сенсорная полинейропатия 1–2-й степени – 13–14% (при ХТ по схеме РА). Местная реакция на перитуморальное введение ФНО-Т возникала через 6–12 часов у всех больных основной группы в виде очага гиперемии 0–1-й степени, слегка болезненного, без инфильтрации, а ее продолжительность варьировалась в пределах 24–48 часов. У четырех (16%) пациенток отмечалась гипертермия 1–2-й степени через 6–12 часов после введения препаратов со снижением до нормальной температуры в течение 24 часов без применения жаропонижающих средств.

Патоморфоз опухоли под действием цитостатиков является важнейшим показателем эффективности лечения. У больных с полным патоморфологическим эффектом статистически выше показатели пяти- и десятилетней общей и беспрогрессивной выживаемости [15]. Согласно классификации выделяют четыре степени лечебного патоморфоза РМЖ [16].

По результатам морфологического исследования опухолевой ткани и перитуморальной ткани больных основной группы в опухоли под действием ХТ в комбинации с перитуморальным введением рекомбинантного ФНО-Т были выявлены изменения, соответствовавшие 3–4-й степени лечебного патоморфоза (рис. 1).

В основной группе на фоне применения комбинации цитостатиков и иммунного препарата отмечалось статистически достоверное увеличение числа лечебного патоморфоза 3–4-й степени по сравнению с контрольной группой – десять (33,2%) и девять (17,34%) случаев соответственно (p < 0,05) (рис. 2) [17, 18].

После проведенной ХТ в сочетании с рекомбинантным ФНО-Т в ткани опухоли молочной железы было обнаружено, что микроциркуляторная плотность в поле зрения для CD31 снижалась с 5,9 ± 0,34 в трепанбиоптатах до 2,24 ± 0,35 в операционном материале (p < 0,05), для CD34 – с 6,88 ± 1,07 до 2,75 ± 0,72 соответственно (p < 0,05). В контрольной группе микрососудистая плотность составила для CD31 9,54 ± 0,89 в трепанбиоптатах и 5,1 ± 0,59 в операционном материале (p < 0,05), для CD34 – 8,2 ± 0,52 и 4,08 ± 0,41 соответственно (p < 0,05) (рис. 3).

При морфологическом исследовании образцов тканей больных основной группы в трепанбиоптатах по сравнению с операционным материалом процент VEGF, EGFR был выше (табл. 2).

На рис. 4 показано уменьшение плотности микрососудов в опухоли на фоне терапии комбинацией химиопрепаратов и ФНО-Т.

В биоптатах опухолей в отсутствие лечения отмечалось преобладание среди иммунокомпетентных клеток, присутствовавших в опухоли, CD4+-лимфоцитов над CD8+- и CD3+-клетками. В-лимфоциты были обнаружены в виде единичных клеток и немногочисленных скоплений. CD4+- и CD3+-лимфоциты определялись в виде скоплений. Инфильтрация CD8+-лимфоцитами опухолевой ткани представлена одиночно расположенными клетками.

Результаты исследования операционного материала у больных основной группы с выявленной 2-й степенью патоморфоза в лимфоидном инфильтрате показали преобладание CD8+-клеток. Уровень CD4+-лимфоцитов существенно не менялся. Данное обстоятельство свидетельствовало о достаточно высоком уровне локального иммунного ответа на опухоль. У пациенток основной группы с 3–4-й степенью патоморфоза опухоли под действием ХТ и рекомбинантного ФНО-Т, введенного перитуморально, лимфоцитарная инфильтрация была слабо выражена, почти отсутствовала. В наблюдениях с сохраненной опухолевой тканью определялась лимфоцитарная инфильтрация различной степени выраженности (рис. 5).

Все пациентки основной группы были прооперированы. Послеоперационных осложнений, связанных с использованием рекомбинантного ФНО-Т, не зафиксировано. Медиана наблюдения в основной группе составила 35,6 ± 1,2 месяца, в группе сравнения – 34,1 ± 1,1 месяца. Медиана выживаемости в обеих группах не достигнута. Тем не менее имело место достоверное увеличение показателей трехлетней безрецидивной выживаемости на 20% (с 63% в контрольной группе до 83% в основной при включении в схему лечения ФНО-Т), логарифмический ранговый критерий 0,0477. Достоверных различий в общей выживаемости между группами к настоящему времени не выявлено.

Заключение

Результаты проведенного исследования отражают достоверное увеличение эффективности нео­адъювантной лекарственной терапии больных РМЖ IIB–IIIB стадии при перитуморальном применении рекомбинантного ФНО-Т. Рост частоты достижения объективного противоопухолевого эффекта обусловлен увеличением случаев полного регресса опухоли. Препарат обладает удовлетворительной переносимостью, не влияет на частоту и степень выраженности системных побочных реакций. Местные побочные реакции клинически незначимы и купируются самостоятельно.

Применение данной методики позволяет сократить сроки предоперационной терапии, достигнуть увеличения числа наблюдений лечебного патоморфоза 3–4-й степени, увеличить трехлетнюю безрецидивную выживаемость на 20%. Одним из возможных механизмов подобного эффекта является угнетение ангиогенеза в опухоли, проявляющегося снижением числа микрососудов в опухоли. Проведенное исследование выявило также активацию локального противоопухолевого иммунитета.