Сравнительное клинико-иммунологическое исследование эффективности комплексного послеоперационного лечения, включающего программы иммуномодулирующей терапии Имунофаном

Таблица 1. Характеристика групп исследования

Рис. 1. Показатели фагоцитарной (А) и микробицидной активности (Б) НГ у детей с местным неотграниченным и разлитым ОП

Рис. 2. Содержание и фенотипические особенности субпопуляций CD16+СD64-CD32+CD11b+НГ и CD16+СD64+CD32+CD11b+НГ у детей с ОП

Таблица 2. Влияние иммуномодулирующей терапии на фенотип субпопуляции СD16+СD64-CD32+CD11b+НГ у детей с различными формами ОП (Me (Q0,25–Q0,75))

Рис. 3. Модулирующие эффекты влияния гексапептида в системе in vitro на количественное соотношение и фенотип субпопуляций НГ у детей с различными формами ОП (значения представлены в виде Ме)

Таблица 3. Влияние иммуномодулирующей терапии на фенотип субпопуляции СD16+СD64+CD32+CD11b+НГ у детей с различными формами ОП (Me (Q0,25–Q0,75))

Рис. 4. Программы иммуномодулирующей терапии с применением Имунофана у детей с нетипично протекающими ОП

Рис. 5. Сравнение иммунологической эффективности программ иммуномодулирующей терапии и традиционного лечения в отношении фенотипа и количественного соотношения субпопуляций НГ у детей с различными формами ОП (значения представлены в виде Ме)

Рис. 6. Сравнительная характеристика клинической эффективности программ иммуномодулирующей терапии и традиционного лечения у детей с различными формами ОП

Введение

Ухудшение экологической обстановки и влияние различных неблагоприятных антропогенных факторов обусловливают неуклонный рост числа вторичных дисрегуляторных расстройств иммунной системы с поражением различных ее звеньев. На фоне развития тяжелых гнойно-воспалительных процессов или рецидивирующих гнойно-воспалительных заболеваний (ГВЗ) основной причиной этого может являться дефект работы основных эффекторных и регуляторных клеток врожденного иммунитета – нейтрофильных гранулоцитов (НГ). При дисфункции в системе НГ невозможно реализовать адекватную противомикробную защиту, что приводит к развитию тяжело протекающих инфекционно-воспалительных заболеваний (ИВЗ), зачастую полиэтиологичных, характеризующихся рецидивированием и/или хронизацией инфекционно-воспалительного процесса.

Описаны различные дисфункции НГ c нарушением фагоцитарной и микробицидной активности [1, 2]. Неадекватное реагирование или отсутствие ответа НГ на внедрение патогенных микроорганизмов является причиной вялотекущих хронических ИВЗ, при которых использование только традиционной терапии недостаточно эффективно [3]. Нарушение функционирования НГ может стать причиной не только повышения заболеваемости ИВЗ, но и инвалидизации и даже высокой летальности при тяжелых ГВЗ [4, 5].

Нарушению функционирования НГ способствуют многие внутренние и внешние факторы, такие как дефицит питательных веществ в организме, персистирующие инфекции, нарушение нормальной микрофлоры открытых и закрытых слизистых оболочек и кожи, частое использование антибактериальных препаратов.

НГ осуществляют противобактериальную защиту путем фагоцитоза, трансмембранной дегрануляции, продукции цитокинов, образования нейтрофильных внеклеточных ловушек (NET) и эктосом [6, 7], изменяя свой фенотип с формированием новых субпопуляций, обладающих различной функциональной активностью [8, 9]. Основополагающие эффекторные процессы НГ находятся в прямой зависимости от плотности экспрессии мембранных рецепторов CD16 (FcγRIII), CD32 (FcγRII), CD11b (Mac-1/CR3A), CD64 (FcγRI), формирующих определенный фенотип клетки, а также от их кооперации. В результате кооперации могут быть запущены механизмы эффективного фагоцитоза или дегрануляции, кислородного взрыва или формирования NETs [3].

Особой проблемой является рост числа заболеваемости острым перитонитом (ОП) среди детей и связанных с ним осложнений, что диктует необходимость поиска и разработки новых тактических приемов лечения [10, 11]. С учетом того что в основе иммунопатогенеза ОП лежат дисфункции НГ, ассоциированные с негативной трансформацией фенотипа и количественного содержания функционально-значимых субпопуляций НГ, представляется необходимым разработка программ иммуномодулирующей терапии, направленных на восстановление нормального функционирования НГ, способствующих оптимизации лечения и профилактике послеоперационных осложнений у иммунокомпрометированных детей с ОП.

Определенный интерес в связи со сказанным ранее представляет иммунотропная субстанция синтетический гексапептид (ГП) – аргинил-α-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин. Это аналог активного центра гормона тимуса – тимопоэтина, обладающий всеми биологическими эффектами нативного гормона [12, 13]. ГП оказывает положительное иммунорегуляторное воздействие на дефектно функционирующую иммунную систему, осуществляет регуляцию и восстановление Т-клеточного звена, нормализацию синтеза цитокинов, влияя на численность и активность НГ, моноцитов, усиливает эффективность антибактериальной терапии. Известны гепатопротективные и антиоксидантные свойства ГП, позволяющие профилактировать множественную лекарственную резистентность [12]. ГП является активной субстанцией отечественного препарата Имунофан, разрешенного к применению у детей с двух лет.

Имунофан хорошо зарекомендовал себя в лечении вторичных иммунных нарушений адаптивного иммунитета при ГВЗ [14, 15]. Однако его целенаправленное действие на НГ остается не­изученным, поэтому представляет определенный научный и практический интерес.

Цель исследования

Целью нашего исследования стала сравнительная клинико-иммунологическая оценка эффективности разработанных программ иммуномодулирующей терапии с использованием Имунофана, включенных в комплексное послеоперационное лечение, с традиционными методами послеоперационного лечения детей с различными формами нетипично протекающих острых перитонитов.

Материал и методы

Для реализации проекта осуществляли иммунофенотипирование с помощью FC 500 (Beckman Coulter, США) и МКАТ (Beckman Coulter International S.A., Франция) НГ периферической крови (ПК) условно здоровых детей, детей с местным неотграниченным ОП (группа 1) и разлитым ОП (группа 2) до и после лечения, а также при выполнении экспериментальной части исследования в системе in vitro.

С учетом клинической симптоматики, клинико-лабораторных показателей и этапов исследования были сформированы следующие группы (табл. 1).

Методом последовательного гейтирования определяли процентное соотношение субпопуляций НГ CD16⁺СD64^-СD32⁺СD11b⁺ и CD16⁺СD64⁺СD32⁺СD11b⁺, плотность экспрессии изучаемых рецепторов – с использованием показателя интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity – MFI). Параллельно оценивали функциональный потенциал НГ. Для оценки фагоцитарной функции НГ образцы ПК инкубировали с Staphylococcus aureus (штамм 209) в течение 120 минут при температуре 37 ºC. Определяли также содержание активно фагоцитирующих НГ (%ФАН), фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ). Для оценки киллинговой активности рассчитывали процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП). Активность NADРН-оксидазы НГ устанавливали с помощью NBT-спонтанного теста (NBTсп) и нагрузочного теста в системе in vitro (NBTст), позволяющих выявить функциональный эффекторный резерв НГ. Рассчитывали средний цитохимический индекс и процент формазан-позитивных клеток (СЦИсп, %ФПКсп и СЦИст, %ФПКст), по соотношению %ФПК в стимулированном и спонтанном NBT- тестах (%ФПКcт/%ФПКсп) – коэффициент мобилизации (КМ) [16].

Отбор детей в группы проводился на базе хирургического отделения № 1 ГБУЗ «Детская краевая клиническая больница» Министерства здравоохранения Краснодарского края с учетом наличия клинических критериальных признаков иммунокомпрометированности [17].

Клинический статус ребенка устанавливали на основании жалоб, данных анамнеза заболевания, жизни и развития, иммунологического анамнеза, оценки объективного статуса и клинического течения основного заболевания.

Математическую обработку полученных результатов проводили с помощью программ Microsoft Exel 2016 и StatPlus 2017. После оценки нормальности распределения лабораторных показателей применяли непараметрические статистические критерии Вилкоксона – Манна – Уитни.

Результаты представлены в виде медианы и 25-го и 75-го квартилей.

Статистически значимые различия определяли при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

При проведении исследования использовался разработанный нами алгоритм иммунодиагностики дефектов функционирования НГ у детей разного возраста с различными нетипично протекающими ГВЗ, который включал оценку критериальных признаков иммунокомпрометированности пациентов [17], количества НГ и особенностей трансформации фенотипов CD16⁺CD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ и CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ, отражающих тяжесть ГВЗ, а также эффекторных функций НГ, а именно фагоцитоз с бактериальным антигеном (БАГ) с параллельной оценкой количества активно фагоцитирующих НГ, процессов захвата, киллинга и переваривания, спонтанной и индуцированной кислород-зависимой микробицидности.

Исходя из анамнеза, в группе 1 частота эпизодов ОРВИ составляла более десяти в год с продолжительностью острого периода более десяти дней, протекающих с осложнениями в виде бактериальных инфекций ЛОР-органов и респираторного тракта шесть и более раз в год и требующих антибактериальной терапии.

В группе 2 частота рекуррентных респираторных инфекций составляла 12 и более в год с продолжительностью заболевания 14–21 дней и более, которые зачастую осложнялись присоединением вторичной бактериальной инфекции верхних и нижних дыхательных путей, ЛОР-органов – восемь раз в год и более, обострением хронических заболеваний респираторного тракта и ЛОР-органов. Детям данной группы назначали антибактериальные препараты курсами – восемь раз в год и более, в том числе парентерально.

Клинические проявления ОП у таких пациентов различались, что во многом зависело от наличия дисфункций НГ.

Показано, что у детей с неотграниченным ОП имело место увеличение количества НГ до 12,5 (10,8–19,9) против 6,4 (5,2–7,4) г/л по сравнению с условно здоровыми детьми (р < 0,05). В группе 1 относительно группы сравнения также зафиксировано повышение %ФАН – 60,2 (60,0–74,0)% против 55,3 (50,0–57,0)% (р < 0,05) на фоне снижения показателей переваривающей активности НГ (%П 45,3 (39,8–63,8)% против 62,6 (57,9–62,9)%, ИП 0,9 (0,7–1,2) против 1,6 (1,3–1,9); р1, 2 < 0,05). При этом показатели NADPH-оксидаз – %ФПКсп, СЦИсп находились на том же уровне, что и в группе сравнения (р1, 2 > 0,05), и отмечалась лишь незначительная тенденция к увеличению при стимуляции S. aureus в стимулированном NBT-тесте (р1, 2 > 0,05), что свидетельствовало о низкой микробицидной активности. В группе 2 выявлена блокада ответа со стороны НГ на тяжелый инфекционно-воспалительный процесс: отсутствие увеличения количества циркулирующих НГ в ПК, а также адекватного ответа на дополнительную бактериальную антигенную нагрузку (S. aureus), поскольку значения, отражающие фагоцитарную способность НГ, были аналогичными показателям группы сравнения. Вместе с тем в отличие от группы сравнения активность NADPH-оксидаз значимо увеличилась в спонтанном тесте (%ФПКсп и СЦИсп – 12,5 (3,8–21,0) и 0,37 (0,12–0,62) против 2,0 (1,0–3,7) и 0,09 (0,06–0,11); р1, 2 < 0,05) и резко снизилась при дополнительной стимуляции БАГ (%ФПКст и СЦИст – 4,0 (1,5–14,0) и 0,12 (0,06–0,40) против 2,0 (1,0–3,7) и 0,09 (0,06–0,11); р1 ,2 < 0,05), что свидетельствовало о напряженности и отсутствии резервного микробицидного потенциала НГ (рис. 1).

В основе нарушений функциональной активности НГ лежит изменение доли функционально-значимых субпопуляций НГ с негативно трансформированным фенотипом. Так, в группе 1 в отличие от группы сравнения выявлено изменение фенотипов  изучаемых субпопуляций за счет перераспределения плотности экспресии: снижения уровня MFI CD32 в обеих субпопуляциях на 62,8 и 26,2% соответственно (р1, 2 < 0,05), снижения уровня MFI СD64 на 56,9% (р < 0,05) и повышения уровня MFI CD11b на 97,9% (р < 0,05) в субпопуляции CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ. Кроме того, доля субпопуляции CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ увеличилась более чем в 40 раз (p < 0,05) за счет снижения содержания субпопуляции CD16⁺CD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ на 24% (р < 0,05) (рис. 2, табл. 2 и 3).

При анализе субпопуляционного состава НГ в группе 2 также установлено перераспределение изучаемых субпопуляций: снижение на 69,7% субпопуляции CD16⁺CD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ (р < 0,05), в группе сравнения повышение с 0,6 (0,3–0,7) до 60,7 (39,5–81,0) субпопуляции CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ и изменение их фенотипов CD16^dimСD64^-CD32^dimCD11b^mid и CD16^dimСD64^dimCD32^midCD11b^dim, что свидетельствовало о снижении способности НГ реализовывать эффекторные функции, быстро элиминировать БАГ и ограничивать воспалительную реакцию на местном уровне и было сопоставимо с тяжестью разлитого ОП (см. рис. 2).

После проведенного стационарного лечения у детей с различными формами ОП, получавших только традиционную терапию (ТТ), были отмечены позитивные клинические эффекты, свидетельствующие об улучшении течения заболевания, однако не нормализовалось функционирование НГ, что в дальнейшем может приводить к развитию послеоперационных осложнений и часто рецидивирующим ГВЗ. Так, в группе 1 ТТ количество активно фагоцитирующих НГ (%ФАН) относительно показателей до лечения снизилось на 34,2% (p < 0,05) с сохранением дефекта переваривающей активности (%П и ИП; р1, 2 > 0,05), микробицидная активность НГ при дополнительной стимуляции БАГ (%ФПКст) – на 86,7%, СЦИст – на 82,6% (p1, 2 < 0,05) с истощением мобилизационного резервного потенциала (р > 0,05). Аналогичное сохранение дефектов НГ было отмечено в группе 2 ТТ. При сравнении с показателями группы 2 также отмечалось снижение активно фагоцитирующих НГ (на 33,9%; p < 0,05), процессов захвата (ФЧ на 52%; p < 0,05 и ФИ на 11%; р > 0,05) и истощение NADPH-оксидазной микробицидной активности. Выявленные сохраняющиеся нарушения микробицидного потенциала НГ были наглядно продемонстрированы и подтверждены при изучении функционально-значимых субпопуляций CD16⁺CD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ
и CD16⁺CD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ, содержание которых и фенотипические характеристики не отличались от показателей до лечения в группах 1 и 2 соответственно (p > 0,05) (см. табл. 2 и 3).

В связи с этим возникла необходимость разработки таргетной иммунокоррекции, направленной на восстановление системы НГ. Поэтому в закрытой системе in vitro было проведено исследование эффектов иммунотропной субстанции ГП в ПК у детей с местным неотграниченным и разлитым ОП и определен его модулирующий эффект. Под влиянием ГП отмечалось увеличение содержания субпопуляции CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ и восстановление ее фенотипических характеристик за счет усиления плотности экспрессии CD16- и CD32-рецепторов – CD16^midСD64^-CD32^midCD11b^mid в обеих группах до показателей группы сравнения. В субпопуляции CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ также наблюдались не только количественные (в группе 1 доля данной субпопуляции снизилась на 30,5%, в группе 2 – на 16,6% относительно соответствующих показателей НГ групп до инкубации; p1, 2  > 0,05), но и фенотипические изменения. В последнем случае речь, в частности, идет о трансформации фенотипа CD16^midСD64^dimCD32^midCD11b^mid при местном неотграниченном ОП и CD16^dimСD64^dimCD32^midCD11b^dim при разлитом ОП (рис. 3). Разнонаправленные реорганизации трансформированного фенотипа НГ под воздействием ГП способствовали восстановлению процессов захвата и переваривания в обеих группах. При этом в группе 1 было отмечено усиление микробицидной активности, в группе 2 – снижение напряженности NADPH-оксидаз в спонтанном NBT-тесте и сохранение резервного потенциала НГ при дополнительной стимуляции БАГ. Выявленные эффекты ГП послужили основанием выбора препарата Имунофан, № Р N000106/04, основной действующей субстанцией которого является ГП, для коррекции дисфункций НГ у детей с различными ГВЗ.

С учетом глубины выявленных дефектов и тяжести течения инфекционного процесса у детей с различными формами ОП нами были разработаны программы таргетной иммуномодулирующей терапии (ИТ), включенные в комплексную послеоперационную терапию (рис. 4).

У детей с местным неотграниченным и разлитым ОП, получавших комплексное послеоперационное лечение с Имунофаном, отмечалась компенсация иммунологических нарушений, чего не наблюдалось в соответствующих группах, находившихся на ТТ. В группе 1 ИТ уровень субпопуляции CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺НГ достиг значений группы сравнения (p < 0,05), а фенотип субпопуляции характеризовался снижением уровня MFI CD32 на 25% (p < 0,05), тенденцией к увеличению уровня MFI CD16 (p > 0,05) и изменением фенотипического профиля CD16^brightСD64^-CD32^dimCD11b^mid
относительно показателей группы 1 (см. табл. 2 и рис. 5). В группе 1 уровень субпопуляции CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ снизился на 94,4% от показателей до лечения, а также наблюдалась реорганизация фенотипа CD16^brightСD64^dimCD32^midCD11b^mid с повышением на 49,0% уровня MFI CD16, на 35,7% уровня MFI CD64 на фоне снижения на 16,5% уровня MFI CD11b (p1–3 < 0,05) (см. табл. 3 и рис. 5).

У детей с разлитым ОП с глубокими дефектами системы НГ после курса комплексной послеоперационной терапии с Имунофаном также наблюдалось количественное восстановление субпопуляции CD16⁺СD64^-CD32⁺CD11b⁺ до значений у условно здоровых детей (p > 0,05) за счет снижения на 98,8% содержания субпопуляции CD16⁺СD64⁺CD32⁺CD11b⁺НГ (p < 0,05) по сравнению с показателями до лечения и появление новых фенотипических профилей CD16^midСD64^-CD32^dimCD11b^bright (см. табл. 2 и рис. 5) и CD16^brightСD64^dimCD32^midCD11b^bright (см. табл. 3 и рис. 5).

При комплексной оценке функциональных возможностей НГ также установлено восстановление процессов захвата и переваривания, нормализация спонтанной и индуцированной NADPH-оксидазной активности с сохранением (в группе 1) или восстановлением (в группе 2) резервных микробицидных возможностей НГ.

Использование в комплексном лечении детей с местным неотграниченным и разлитым ОП иммуномодулирующей терапии с Имунофаном обеспечивало высокую клиническую эффективность. Так, в группе 1 ИТ субфебрильная температура тела отмечалась в течение 2,0 (1,0–2,5) дня в послеоперационном периоде, тогда как в группе 1 ТТ – на 2–3 дня дольше, то есть в течение 5,0 (4,5–5,0) дня. Другие проявления интоксикационного синдрома (бледность кожных покровов, тошнота, слабость, головокружение) в группе 1 ИТ регрессировали через 3,5 (3,0–5,0) дня. В группе 1 ТТ продолжительность интоксикационного синдрома составила 5,5 (5,0–7,0) дня. В группе 1 ИТ ранних осложнений послеоперационного периода в виде нагноения швов не зарегистрировано. В группе 1 ТТ не обнаружено восстановления адекватного функционирования НГ. Как следствие, в послеоперационном периоде нагноение швов отмечалось у всех детей данной группы с продолжительностью выделений гнойного характера из послеоперационной раны до 4,0 (3,5–4,0) дня, однако это не требовало дополнительного хирургического пособия (рис. 6).

В группе 2 ИТ в послеоперационном периоде подъем температуры тела до субфебрильных цифр с литическим снижением наблюдался в течение 4,0 (3,0–4,5) дня, тогда как в группе 2 ТТ нормализация субфебрильной температуры зафиксирована только к 6,0 (5,5–6,5) дню. Выраженный интоксикационный синдром после операции в группе 2 ИТ регистрировался в более ранние сроки, чем в группе 2 ТТ, – через 5,0 (4,5–5,5) и 7,5 (6,5–8,0) дня соответственно. Сократилось в два раза количество койко-дней, проведенных в отделении реанимации, у получавших ИТ с первых послеоперационных суток. Так, в группе 2 ИТ количество койко-дней составило 2,0 (1,0–2,5), в группе 2 ТТ – 4,0 (3,5–4,0). Дренирование брюшной полости в группе 2 ТТ было продолжительным и составило 5,0 (4,5–5,0) дня, в группе 2 ИТ – 3,0 (2,0–3,0) дня с последующим удалением дренажа, что существенно снижает риск вторичного инфицирования. Следует отметить, что в группе 2 ИТ не наблюдалось нарушения нормальной моторики желудочно-кишечного тракта, тогда как в группе 2 ТТ в 80% случаев встречался парез кишечника, являющийся дополнительным источником интоксикации, симптомы которого купировались через шесть дней после операции (см. рис. 6).

Полученные результаты в отношении положительных клинико-иммунологических эффектов Имунофана при добавлении к комплексному лечению детей с различными формами нетипично протекающих ОП согласуются с данными литературы о положительном влиянии препарата в составе комплексной терапии различных иммунозависимых заболеваний, таких как туберкулез, гепатит, псориаз, дифтерия, хронический бруцеллез, злокачественных заболеваний, оппортунистических инфекций, тяжелых ГВЗ [14, 15, 18–20].

Заключение

Сравнение иммунопатогенетически обоснованного использования Имунофана в комплексном лечении детей с нетипично протекающими местным неотграниченным и разлитым ОП с традиционной терапией показало выраженную клинико-иммунологическую эффективность первого метода. Восстановление соотношения функционально-значимых субпопуляций НГ, ремоделирование их негативно трансформированных фенотипов и, как следствие, полноценное восстановление микробицидных функций в 100% случаев позволило избежать ранних послеоперационных осложнений. Несмотря на позитивные клинические эффекты, при использовании только традиционной терапии не отмечалось восстановления дефектов системы НГ, что проявлялось в виде нагноения швов (у 100% детей с местным неотграниченным ОП) и пареза кишечника (у 80% детей с разлитым ОП). Как следствие, требовалась дополнительная симптоматическая терапия.

Оптимизация лечения с помощью Имунофана на фоне восстановления дисфункций НГ повлияла на клинические проявления различных форм ОП. В частности, наблюдалось уменьшение длительности лихорадочного периода в 2,5 и 1,5 раза в группах с местным неотграниченным и разлитым ОП соответственно, выраженности интоксикационного синдрома в 1,5 раза в обеих группах, в 1,6 раза случаев дренирования брюшной полости, в 2 раза сроков пребывания в реанимационном отделении (при разлитом ОП).

Таким образом, использование разработанных дифференцированных программ, учитывающих тяжесть течения воспалительного процесса и глубину дефектов функционирования НГ, в составе комплексного послеоперационного лечения детей с различными формами нетипично протекающих ОП не только эффективно, но и целесообразно.

Финансирование
Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031000071-4.