Позитивное ремоделирование под влиянием синтетического тимического гексапептида негативно трансформированных субпопуляций CD16+CD62L+CD63- и CD16+CD62L+CD63+ нейтрофильных гранулоцитов иммунокомпрометированных женщин с хроническими инфекционно-воспалитель

Таблица 1. Количественная и фенотипическая характеристика субпопуляций CD16+CD62L+CD63- НГ и CD16+CD62L+CD63+ НГ у иммунокомпрометированных женщин с хроническими инфекционно-воспалительными заболеваниями на фоне применения традиционной терапии и комплексн

Таблица 2. Клиническая эффективность применения препарата Имунофан® у иммунокомпрометированных женщин при обострении ХИВЗГТ (М ± m)

Хронические инфекционно-воспалительные заболевания (ХИВЗ) различной локализации и их осложнения являются сложной проблемой клинической медицины, поскольку существуют определенные трудности как для диагностики, так и для лечения этих заболеваний. Количество случаев ХИВЗ в популяции достигает 60–70%, при этом количество обострений ХИВЗ имеет широкую вариативность – от 2 до 12 раз в год, которая зависит от этиологического фактора и состояния иммунной системы [1].

К хроническим инфекционно-воспалительным заболеваниям генитального тракта (ХИВЗГТ) относят спектр воспалительных заболеваний верхнего отдела генитального тракта у женщин, которые могут быть представлены как одной формой (эндометрит, сальпингит, оофорит), так и их различными комбинациями. ХИВЗГТ по-прежнему остаются ведущими в структуре гинекологических заболеваний во всем мире. Ввиду высокой медицинской и социально-экономической значимости данной патологии остро стоит вопрос углубленного изучения их иммунопатогенеза и разработки принципиально новых подходов к лечению [2, 3].

В ряде многоцентровых исследований показано, что особенностью современной этиологической структуры ХИВЗГТ является смешанный характер микробного пейзажа на фоне возрастания дисбиотических нарушений влагалища [4–6]. Несмотря на успехи, достигнутые в купировании воспалительного процесса в генитальном тракте, отмечается увеличение случаев заболеваний, трудно поддающихся лечению, носящих рецидивирующий характер, а также нередко непрерывно рецидивирующее течение. Эти клинические проявления могут свидетельствовать о наличии у женщин с ХИВЗГТ нарушений функционирования иммунной системы – вторичного иммунодефицита. В этой связи уделяется особое внимание разработке новых стратегий комплексного лечения ХИВЗГТ с использованием таргетной иммуномодулирующей терапии [7].

Одним из ключевых направлений для обоснования иммунопатогенетических подходов к лечению иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ является изучение вариантов нарушений функционирования нейтрофильных гранулоцитов (НГ), которые, являясь первой линией иммунной защиты, должны осуществлять мгновенную эффективную противобактериальную, противовирусную и противогрибковую защиту после контакта с патогенами, их захват, киллинг и элиминацию. При этом эффекторные функции НГ, необходимые для уничтожения патогенов, тесно связаны с основными поверхностными мембранными рецепторами.

СD16 (FcγRIII) – рецептор, отвечающий за цитотоксическое действие, дегрануляцию, кислородный взрыв [8, 9]. CD62L- и CD63-рецепторы регулируют активацию подвижности, адгезии и дегрануляции НГ [10–12]. С негативной трансформацией фенотипа субпопуляций НГ, экспрессирующих данные рецепторы, ассоциированы нарушения их микробицидной активности, что связано с возникновением нетипично протекающих инфекционно-воспалительных заболеваний. В связи с этим актуальным представляется изучение таргетного воздействия иммунотропных препаратов на дефектно функционирующие НГ.

Согласно современным данным, гексапептид (ГП, аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин), являющийся синтетическим аналогом активного центра гомона тимуса тимопоэтина, оказывает положительные клинико-иммунологические эффекты при различных иммунозависимых заболеваниях [13]. При этом эффекты влияния ГП на дефектно функционирующие НГ у иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ остаются малоизученными.

Цель исследования – оценить эффекты влияний препарата Имунофан® – синтетического тимического гексапептида, включенного в комплексное лечение иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ, на клиническую эффективность и ремоделирование субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD63^- и CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ нейтрофильных грануло­цитов.

Материал и методы

Проведено исследование НГ в образцах периферической крови (ПК) 122 женщин репродуктивного возраста (от 20 до 40 лет) в период обострения ХИВЗГТ, поступивших в отделение дневного стационара Клиники ФГБОУ ВО КубГМУ Минздрава России.

Группу исследования (ГИ) составили 122 женщины с ХИВЗГТ в период обострения до лечения (ГИ до лечения).

Для оценки клинико-иммунологической эффективности проводимого комплексного лечения были сформированы две группы исследования в соответствии с терапевтической тактикой. Группа исследования (ГИ ТТ после лечения) – 22 женщины с обострением ХИВЗГТ, получавшие только традиционную терапию. Традиционная терапия включала прием антибактериальных препаратов группы цефалоспоринов третьего поколения (цефтриаксон) 250 мг внутримышечно один раз в сутки курсом 14 дней, макролидов (кларитромицин) 500 мг два раза в сутки, метронидазола 500 мг один раз в сутки в течение пяти дней, противогрибковых препаратов (флуконазол) 150 мг на первый, шестой и девятый дни лечения, витаминов группы В тиамин 50 мг и пиридоксин 10 мг внутримышечно с чередованием через день в течение 14 дней, а также местную антисептическую терапию – применение суппозиториев (хлоргексидин) вагинально в течение 14 дней.

Группа исследования (ГИ ТТ + ИТ после лечения) – 100 женщин с обострением ХИВЗГТ, получавшие традиционную терапию и иммунотерапию фармпрепаратом, основной действующей субстанцией которого является синтетический тимический гексапептид: 45 мкг/мл 1 мл внутримышечно один раз в сутки в течение десяти дней (курсовая доза – 450 мкг).

В группу сравнения (ГС) вошли 20 условно здоровых женщин репродуктивного возраста.

Тестирование НГ ПК проводилось в ГИ до лечения и через два-три дня после окончания курса лечения (ГИ ТТ и ГИ ТТ + ИТ). Определяли процентное содержания субпопуляций НГ (%НГ), одномоментно несущих CD16-, CD62L-, CD63-рецепторы, и плотность экспрессии данных рецепторов по интенсивности флюоресценции (mean fluorescent index, MFI) методом проточной цитометрии (Cytomics FC-500, США) с применением соответствующих моноклональных антител.

Статистическую обработку данных осуществляли в компьютерных программах Microsoft Excel 2016 и StatPlus 2010. Использовали критерий Стьюдента для оценки клинических параметров (M ± m) и непараметрические статистические критерии Вилкоксона и Манна – Уитни для оценки иммунологических параметров (Me (Q1; Q3)). Статистически значимые различия определяли при p < 0,05.

Результаты и их обсуждение

У всех женщин исследуемой группы нами были уточнены основные критериальные клинические признаки иммунокомпрометированности, относящиеся к генитальной патологии [14]:

• значительная длительность анамнеза заболевания (более пяти лет);
• высокая частота обострений ХИВЗГТ (три и более раз в год);
• вялотекущий и затяжной характер течения обострений ХИВЗГТ;
• отсутствие или недостаточный клинический эффект от проведения традиционного лечения ХИВЗГТ (системной и местной антимикробной и антисептической терапии).

Кроме того, при изучении данных анамнеза у женщин с ХИВЗГТ были определены и дополнительные критериальные признаки иммунокомпрометированности. Так, в 16,3% случаев присутствовали латентные или рецидивирующие герпесвирусные инфекции (ГВИ), вызванные вирусом простого герпеса (ВПГ) I и II типов, инфекции генитальной и орофациальной локализации с частотой обострений до пяти-шести раз в год, папилломавирусная инфекция (кондиломы аногенитальной области) выявлена в 20,5% случаев, рекуррентные ОРВИ с частотой эпизодов до семи-восьми раз год – в 8,2% случаев.

При оценке результатов исследования установлено, что в образцах ПК условно здоровых женщин (ГС) регистрировались две субпопуляции НГ – CD16⁺CD62L⁺CD63^-, количество которой составило 97,8 (97,5; 98,5)%, и CD16⁺CD62L⁺CD63⁺, уровень которой составил 2,7 (1,5; 5,6)% (табл. 1).

У иммунокомпрометированных женщин ГИ до лечения в период обострения ХИВЗГТ отмечалось снижение количества НГ субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^- до 96,6 (93,8; 97,1)% (р < 0,05) на фоне увеличения количества НГ субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ до 4,4 (2,4; 11,2)% относительно показателей ГС (р > 0,05). Кроме того, выявлена негативная трансформация фенотипа обеих субпопуляций. Так, обращало на себя внимание снижение уровня экспрессии CD16 в 1,3 раза, CD62L в 1,3 раза в субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ относительно ГС (р_{1, 2} < 0,05). При этом в субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ зафиксировано статистически значимое уменьшение плотности экспрессии CD16 по MFI – в 1,3 раза (р < 0,05). Плотность экспрессии CD62L по MFI имела тенденцию к снижению – 8,0 (6,3; 11,8) (р > 0,05), а плотность экспрессии CD63, наоборот, была повышена в 3,7 раза относительно ГС (р < 0,05) (см. табл. 1).

Выявленные нарушения рецепторных функций НГ у иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХИВЗГТ, регистрируемое снижение количества НГ субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^-, соответствующей зрелым функционально активным клеткам, и увеличение НГ субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺, характеризующейся высокой цитотоксической активностью и повышенной способностью к образованию нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей (NETs). Появление субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ, обладающей высокой цитотоксической активностью, вероятно, приводит к более выраженному повреждению ткани, усугублению течения воспалительного процесса. Трансформация фенотипа изучаемых субпопуляций свидетельствует о дефектах функционирования НГ: нарушении процессов хемотаксиса в очаге воспаления и адгезии НГ (снижение уровня экспрессии рецепторов CD16 и CD62L в обеих субпопуляциях) на фоне усиления процессов дегрануляции, о чем свидетельствует увеличение плотности экспрессии CD63 и повышение количества субпопуляции НГ CD16⁺CD62L⁺CD63⁺, обладающей повышенной цитотоксической активностью.

Использование стандартной этиотропной терапии у иммунокомпрометированных женщин ГИ ТТ не привело к коррекции выявленных дисфункций НГ изучаемых субпопуляций. В ГИ ТТ сохранялся сниженный уровень субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ (95,8 (93,4; 97,2)%) относительно ГС (р < 0,05), уровень экспрессии CD16 по MFI имел тенденцию к повышению (140,0 (126,0; 175,0)) относительно ГИ до лечения (р > 0,05), а уровень экспрессии CD62L по MFI оставался сниженным и составлял 12,3 (11,5; 14,4) относительно ГС (р < 0,05). Содержание субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ сохранялось на уровне показателей ГИ до лечения и было повышено относительно ГС – 5,2 (4,7; 11,9) против 2,7 (1,5; 5,6)% (p > 0,05). Уровни плотности экспрессии изучаемых рецепторов в обеих субпопуляциях также статистически значимо не изменялись и не отличались от показателей у женщин с ХИВЗГТ до лечения. Эти данные свидетельствуют о неполноценном восстановлении функции НГ и, как следствие, сохранении признаков иммунокомпрометированности на фоне позитивных клинических эффектов, связанных с купированием основных симптомов обострения ХИВЗГТ. Полученные результаты указывают на то, что сохраняется риск поддержания воспалительного процесса и высокая вероятность возникновения рецидивов ХИВЗГТ в краткосрочном периоде после окончания терапии, что и было подтверждено. У женщин ГИ ТТ возникновение рецидива заболевания было зарегистрировано уже через три месяца после лечения в 13,6% случаев, а через шесть месяцев – в 36,4% случаев.

Применение иммуномодулирующей терапии показало позитивные изменения иммунологических показателей. Так, в ГИ ТТ + ИТ выявлено увеличение количества субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ до 97,2 (95,5; 97,9)% относительно ГИ до лечения и ГИ ТТ (p_{1, 2} > 0,05), которое достигло уровня условно здоровых женщин (p > 0,05). Отмечалось также статистически значимое увеличение плотности экспрессии СD16 (142,0 (135,1; 173,0)) и CD62L (14,2 (12,4; 16,2)) относительно ГИ до лечения (p_{1, 2} < 0,05). Количество субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ имело тенденцию к снижению до 1,0 (0,4; 2,6)% относительно ГИ до лечения и ГИ ТТ + ИТ (p_{1, 2} > 0,05). При этом уровень экспрессии CD16 составил 85,5 (74,7; 150,0) (p > 0,05). Плотность экспрессии CD62L имела тенденцию к повышению относительно ГИ до лечения и составила 10,4 (6,2; 14,2) (p > 0,05), а уровень экспрессии CD63 статистически значимо снизился в 2,9 раза относительно ГИ до лечения (p < 0,05) (см. табл. 1).

Таким образом, на фоне комплексного лечения иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХИВЗГТ с включением ГП продемонстрированы положительные иммунологические эффекты, заключавшиеся в перепрограммировании негативно измененного фенотипа изучаемых субпопуляций НГ, а также в перераспределении соотношения функционально значимых субпопуляций – увеличении количества основной субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ и уменьшении субпопуляции CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ с высокой цитотоксической активностью и способностью к дегрануляции и образованию NETs.

Положительные иммунологические эффекты сопровождались позитивной клинической динамикой при проведении таргетной иммуномодулирующей терапии в комплексном лечении иммунокомпрометированных женщин в период обострения ХИВЗГТ.

Отмечен регресс воспалительного процесса при обострении ХИВЗГТ в виде более быстрого уменьшения болевого синдрома, изменения характера и количества выделений из половых путей, субъек­тивных ощущений (табл. 2).

Оценка отдаленных результатов показала, что через шесть месяцев лечения в 90% случаев обострений ХИВЗГТ не было. Однако в 10% случаев возникло обострение ХИВЗГТ вследствие медицинских манипуляций (биопсия шейки матки, ЭКО с предшествующим введением глюкокортикостероидов) и незащищенных половых контактов. Кроме того, в 100% случаев как во время лечения препаратом на основе ГП, так и в более поздние сроки после лечения побочных эффектов иммунотерапии не зарегистрировано.

Заключение

Новое решение проблемы лечения иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ предполагает использование новых, патогенетически обоснованных методов иммунодиагностики субпопуляций НГ, а также применение для восстановления нарушенных функций НГ иммунопатогенетически обоснованных иммунотропных препаратов. Одним из таких перспективных препаратов является синтетический тимический ГП – действующая субстанция препарата Имунофан®, — таргетно влияющий на дефектно функционирующие НГ: восстанавливающий фагоцитарную функцию, нормализующий количество субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ и CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ, снижающий цитотоксическую активность НГ посредством перераспределения рецепторного оснащения изучаемых субпопуляций.

В настоящем исследовании нами продемонстрировано, что позитивное ремоделирование под влиянием ГП негативно трансформированных как количественных характеристик, так и фенотипических особенностей субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ и CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ у иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ сопровождалось позитивной клинической динамикой. Позитивная клиническая эффективность заключалась в более быстром регрессе симптомов обострения ХИВЗГТ и, что немаловажно, более быстром регрессе болевого синдрома. Кроме того, продемонстрировано достижение стойкого протективного эффекта, о чем свидетельствуют данные, полученные при оценке отдаленных результатов исследования. Так, показано при наблюдении в катамнезе, что через шесть месяцев после проведенного комплексного лечения, включавшего применение ГП, в 90% случаев обострений ХИВЗГТ не наблюдалось.

Ранее нашими исследованиями было установлено, что препарат Имунофан®, являясь синтетическим аналогом активного центра гормона тимуса тимопоэтина, способствовал у иммунокомпрометированных женщин с ХИВЗГТ восстановлению и других нарушенных механизмов противоинфекционной защиты, в частности дефектных функций Т-лимфоцитов, естественных киллерных клеток, повышению уровня сывороточного ИФН-α [14]. Кроме того, позитивная клиническая эффективность, с нашей точки зрения, достигается, по-видимому, и за счет того, что ГП, как показано другими авторами, обладает антиоксидантными свойствами, способен усиливать эффективность антибактериальной терапии и ингибировать множественную лекарственную устойчивость [15, 16].

Таким образом, нами показано, что нетипично протекающие инфекционно-воспалительные процессы у женщин с ХИВЗГТ ассоциированы с негативной трансформацией субпопуляций CD16⁺CD62L⁺CD63⁺ НГ и CD16⁺CD62L⁺CD63^- НГ, которая обусловливает нетипичность течения обострений ХИВЗГТ, их высокую частоту, вялотекущий и затяжной характер. Включение в стандартную терапию в период обострения ХИВЗГТ препарата, основной активной действующей субстанцией которого является ГП, оказало позитивное влияние на состояние изучаемых субпопуляций – их позитивное ремоделирование, а также позволило достичь позитивной клинической эффективности, в том числе протективного эффекта.

Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.