Таргетная иммунокоррекция двух негативно трансформированных субпопуляций нейтрофильных гранулоцитов при острой деструктивной пневмонии у детей раннего возраста

Рис. 1. Содержание общего числа лейкоцитов и количества НГ периферической крови у детей с ОДП

Рис. 2. Содержание и фенотипические особенности субпопуляции СD64-CD16+CD32+CD11b+ у детей двух – четырех лет с ОДП

Рис. 3. Содержание и фенотипические особенности субпопуляции СD64+CD16+CD32+CD11b+ у детей двух – четырех лет с ОДП

Рис. 4. Фагоцитарная (А) и микробицидная НАДФН-зависимая (Б) активность нейтрофильных гранулоцитов детей с острой деструктивной пневмонией двух – четырех лет

Рис. 5. Программа иммуномодулирующей терапии с применением гексапептида в лечении детей с нетипично протекающими острыми деструктивными пневмониями

Табл. 1. Особенности трансформации фенотипа субпопуляций СD64-CD16+CD32+CD11b+ и СD64+CD16+CD32+CD11b+ нейтрофильных гранулоцитов детей с острой деструктивной пневмонией до и после курса иммуномодулирующей терапии (Me (Q1; Q3))

Введение

Гнойно-воспалительные заболевания (ГВЗ) остаются одной из первостепенных и серьезных проблем здравоохранения, так как количество пациентов с ГВЗ не имеет тенденции к снижению как среди взрослого, так и среди детского населения и составляет 35–40% случаев среди всех хирургических заболеваний [1, 2]. На долю различных форм острой деструктивной пневмонии (ОДП) приходится от 10 до 15% от общего количества пневмоний у детей [3, 4]. Чаще всего ОДП встречается в раннем детском возрасте (1–3 года – 47,48%) и характеризуется высоким процентом летальных случаев (от 2 до 13%) или переходом в хронические формы (от 5 до 30%) [3]. Формы ОДП и клинические варианты течения болезни находятся в непосредственной зависимости от вида возбудителя, возраста пациента, иммунологической реактивности организма, что и объясняет высокую тенденцию развития ОДП в раннем детском возрасте, для которого характерны изменения в иммунном ответе, связанные с незрелостью иммунной системы (ИС) [5]. В настоящее время все чаще в практическом здравоохранении фиксируются заболевания с измененным клиническим течением, возрастает число заболеваний, вызванных условно-патогенными микроорганизмами, не отвечающих на стандартизированную терапию, что обусловлено дисбалансом функционирования ИС и в первую очередь дисфункциями нейтрофильных гранулоцитов (НГ) [6].

Нейтрофильные гранулоциты инициируют противобактериальную, противовирусную и противогрибковую защиту, запуская каскад реакций для реализации полноценного иммунного ответа организма. НГ – уникальная популяция многофункциональных клеток, которая осуществляет разнообразные функции: фагоцитоз, дегрануляцию, продукцию активных форм кислорода (АФК), образование внеклеточных нейтрофильных экстрацеллюлярных сетей, регуляцию клеток адаптивного иммунитета. Благодаря мощному рецепторному аппарату НГ моментально отвечают на малейшие изменения в их микроокружении перестройкой фенотипа и, как следствие, модификацией функциональной активности. Такая пластичность НГ позволяет регулировать и предопределять дальнейшее течение и исход бактериального воспалительного процесса. Разнообразные фенотипические профили субпопуляций НГ способствуют проявлению различных функциональных возможностей НГ: от состояния «полной неотвечаемости» при блокаде ответа на антиген, характеризующегося неспособностью осуществлять полноценную противомикробную защиту, до гиперактивации НГ с повреждающим действием на клетки, ткани и органы, с развитием иммунотромбозов и системного воспаления [7–10]. Основой иммунопатогенеза ГВЗ, не отвечающих на стандартизированные терапевтические тактики, является неполноценное функционирование НГ в реализации иммунного ответа. Известны различные изолированные или комбинированные дефекты НГ, обусловленные нарушениями рецепторного аппарата НГ, микробицидной и фагоцитарной активности НГ [8, 11].

У детей с дисфункциями НГ, как правило, отмечаются критериальные клинические признаки иммунокомпрометированности: частые, до 10–15 раз в год, острые респираторно-вирусные инфекции, осложняющиеся присоединением бактериальных инфекций респираторного тракта и ЛОР-органов; латентные и рецидивирующие моно- или микст-герпесвирусные инфекции с частыми обострениями хронических очагов инфекций, развитием тяжелых острых и рецидивирующих бактериальных инфекций различных органов и систем. В лечении таких пациентов используются частые (6–8 раз в год) и продолжительные курсы препаратов антибактериальной направленности как перорально, так и парентерально [6]. При ГВЗ на фоне имеющихся дефектов функционирования ИС, в частности дисфункций НГ и влияний хирургических вмешательств, агрессивное воздействие антибактериальных препаратов приводит к еще большему снижению защитных функциональных возможностей организма.

Ведутся активные научные исследования, целью которых являются поиск причин и исследование механизмов развития различных дисфункций НГ в иммунопатогенезе нетипично протекающих ГВЗ. Установлено дифференциально-диагностическое значение определения CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺- и CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺- субпопуляций НГ при неонатальном сепсисе и врожденной пневмонии, выявлена взаимосвязь количества и фенотипической оснащенности этих субпопуляций у детей с ГВЗ мягких тканей и с острыми перитонитами различного течения, ассоциированными с несостоятельностью эффекторных и микробицидных функциональных механизмов НГ [13, 14].

Согласно литературным данным, использование в лечении ГВЗ иммунотропных препаратов (Ронколейкин, Бестим, Галавит, Полиоксидоний, Ликопид и др.) оказывает позитивный клинический эффект и улучшает исход заболеваний, но наибольшее количество исследований, посвященных проведению иммунотерапии при ГВЗ, проведено у взрослых пациентов и, как правило, направлено на изучение коррекции дефектов функционирования адаптивного звена ИС [15–18]. В связи с этим остается актуальной задачей поиск иммунотропных препаратов, целенаправленно модулирующих дисфункции НГ, с целью восстановления полноценной противобактериальной защиты.

Гексапептид (ГП) – аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин – является синтетическим аналогом активного центра гомона тимуса тимопоэтина, который обладает всеми биологическими свойствами нативного гормона тимуса, и действующим веществом лекарственного препарата Имунофан [19, 20]. Препарат получил широкое применение в лечении различных иммунозависимых заболеваний. ГП отличается способностью проявлять дезинтоксикационные, гепатопротекторные, антиоксидантные и иммунорегуляторные свойства – индуцирует раннюю дифференцировку Т-лимфоцитов, а также может усиливать эффективность антибактериальной терапии и ингибировать множественную лекарственную устойчивость, что является перспективным для его использования в коррекции дефектов функционирования НГ детей с нетипично протекающими ОДП для улучшения эффективности послеоперационного лечения [20, 21].

Цель работы – разработать программу иммуномодулирующей терапии в лечении иммунокомпрометированных детей с острой деструктивной пневмонией с последующей оценкой ее клинико-иммунологической эффективности.

Материал и методы

Проведено проспективное нерандомизированное контролируемое сравнительное исследование. Под нашим наблюдением находились 10 детей двух – четырех лет (шесть мальчиков, четыре девочки) с диагнозом «острая деструктивная пневмония» (группа исследования), поступивших на стационарное лечение в хирургическое отделение № 1 ГБУЗ «Детская краевая клиническая больница» МЗ Краснодарского края. У всех детей собран анамнез для выявления клинических признаков иммунокомпрометированности по программе «Иммунологический анамнез», разработанной И.В. Нестеровой (1992). В послеоперационном лечении детей, вошедших в группу исследования, использовали стандартные терапевтические подходы (антибактериальная, инфузионная и дезинтоксикационная терапия), а также дополнительно применяли разработанную нами программу иммуномодулирующей терапии, включающую ГП. Контрольную группу сравнения составили 16 условно-здоровых детей (восемь мальчиков, восемь девочек), сопоставимых по возрасту.

Иммунологическое исследование периферической крови (ПК) пациентов осуществляли после дренирования плевральной полости и при выписке, после курса комбинированной терапии. Методом проточной цитометрии (FC 500 Beckman Coulter, США) определяли количество (в %) НГ субпопуляций CD64^-CD32⁺CD16⁺CD11b⁺, CD64⁺CD32⁺CD16⁺CD11b⁺ и их фенотип по интенсивности экспрессии (MFI) изучаемых рецепторов. Использованы конъюгаты моноклональных антител: CD64 – FITC, CD32 – PE, CD16 – ECD, CD16 – РE, CD11b – PC5 (Beckman Coulter International S.A., Франция). Изучали фагоцитарную активность НГ с оценкой завершенности фагоцитоза с Staphylococcus аureus (штамм 209) по показателям: количество активно фагоцитирующих НГ (процент функциональной активности нейтрофилов (%ФАН)); процессы захвата (фагоцитарное число (ФЧ), фагоцитарный индекс (ФИ)); переваривающая активность (процент переваривания (%П), индекс переваривания (ИП)); НАДФ-оксидазная активность – по показателям NBT-теста, спонтанного и стимулированного (S. aureus), учитывая процент формазан-позитивных НГ (ФПК), средний цитохимический индекс (СЦИ); по соотношению %ФПКст/%ФПКсп рассчитывался коэффициент мобилизации (КМ) [22].

Исследования проводили с соблюдением требований Хельсинкской декларации Всемирной медицинской ассоциации (WMA Declaration of Helsinki – Ethical Principles for Medical Research Involving Human Subjects, 2013). У всех родителей участвующих в исследовании детей было получено информированное согласие на сбор и обработку анамнестических данных, забор ПК, проведение лабораторных исследований и использование иммуномодулирующих лекарственных препаратов.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием компьютерных программ StatPlus (версия 17.0 для Windows, StatSoft Inc, США). В ходе анализа полученных данных оценивали правильность распределения выборки. Использовали методы непараметрической статистики: результаты представляли в виде медианы (Ме) и интерквартильного размаха (Q1; Q3). Для установления значимости различий между количественными показателями независимых групп (исследуемые группы, группа сравнения) использовали непараметрический U-критерий Манна – Уитни. Различия определяли статистически значимыми при p < 0,05.

Результаты исследования

По данным анамнеза, у 100% пациентов, вошедших в группу исследования, выявлялись критериальные признаки иммунокомпрометированности. Дети страдали острыми респираторными вирусными инфекциями длительностью более двух недель от 10 раз в год с частыми осложнениями и присоединением острой или обострением хронической бактериальной инфекции респираторного тракта и ЛОР-органов. У 80% пациентов отмечалось наличие персистирующей герпесвирусной инфекции первого и второго типа лабиальной локализации. При этом у всех детей выявлено снижение чувствительности к проводимой стандартной антибактериальной терапии.

При проведении иммунологического исследования у детей с ОДП на фоне незначительного лейкоцитоза (13,075 (11,1; 16,55) × 10⁹/л против 7,25 (6,67; 8,25) × 10⁹/л в группе сравнения (р < 0,05)) наблюдалось увеличение количества НГ до 70,5 (67,0; 74,0)% против 41,0 (37,0; 47,0)% в группе сравнения (р < 0,05) на фоне повышения доли палочкоядерных форм НГ – 12,5 (7,75; 17,5)%, что свидетельствует о вовлечении в воспалительный процесс незрелых НГ (рис. 1).

При проведении иммунофенотипирования НГ условно-здоровых детей двух – четырех лет определены две функционально значимые субпопуляции: мажорная CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, содержание которой составило 96,01 (95,58; 97,60)%, и минорная CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺, на которую приходится 1,75 (1,40; 1,93)% циркулирующих НГ. Субпопуляция CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ имела уровень экспрессии CD16 – 132,5 (119,5; 144,50), CD32 – 5,06 (4,34; 6,18), CD11b – 22,4 (22,18; 25,75) (рис. 2). Субпопуляция CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ имела более низкую MFI CD16 – 91,55 (82,18; 106,48) и не отличалась по уровню экспрессии CD32 – 6,51 (5,02; 8,92) и CD11b – 19,8 (13,40; 26,93) от мажорной субпопуляции, но была дополнительно хорошо оснащена CD64-рецептором (MFI CD64 – 9,35 (9,24; 9,57)) (рис. 3).

При изучении показателей ПК детей с ОДП установлено снижение содержания мажорной субпопуляции НГ в 1,7 раза (до 55,77 (35,24; 74,83), р < 0,05) относительно показателей группы сравнения. При этом отмечалось уменьшение плотности экспрессии CD16 (112,25 (86,15; 115,75), р < 0,05) и CD11b  (15,2 (14,7; 15,55), р < 0,05) с неизмененным MFI CD32 (р > 0,05) (рис. 2).

Содержание минорной субпопуляции CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ НГ увеличилось в 30 раз (до 52,6 (41,78; 54,99)) против 1,75 (1,40; 1,93) в группе сравнения (р < 0,05). В данной субпопуляции в группе исследования зарегистрирован сниженный в три раза уровень экспрессии CD64 (3,1 (2,94; 3,43)) по сравнению с показателями условно-здоровых детей (р < 0,05). Напротив, MFI CD11b статистически значимо увеличивался до 31,2 (27,3; 35,2) против 19,8 (13,40; 26,93) в группе сравнения (р < 0,05), в отношении уровня экспрессии рецепторов CD16 и СD32 выявлена тенденция к увеличению (р_1,2 > 0,05) (рис. 3).

Изменения соотношения содержания функционально значимых субпопуляций и негативная трансформация их фенотипа отразились на способности НГ полноценно осуществлять эффекторные функции. Так, при оценке фагоцитарной функции НГ при ОДП выявлено неадекватное повышение активно фагоцитирующих НГ (%ФАН 60,0 (47,0; 67,0)% против 55,3 (54,0; 57,0)%, р < 0,05) у условно-здоровых детей. При этом были снижены показатели поглотительной способности НГ: ФЧ – 2,9 (2,7; 3,3) против 4,1 (3,7; 5,7), р < 0,05; ФИ – 1,8 (1,3; 1,9) против 2,5 (1,8; 3,3) в группе сравнения (р > 0,05). Также выявлено снижение процессов переваривания: %П – 46,9 (40,7; 49,9)% против 61,62 (57,9; 62,9)% и ИП – 0,8 (0,3; 1,03) против 1,57 (1,37; 1,88) в группе сравнения (p₁ < 0,05, p₂ < 0,05). В то же время в группе с ОДП отмечалось значительное увеличение спонтанной (%ФПКсп – 6,0 (4,5;14,0)% против 3,5 (3,0; 4,0)% у условно-здоровых детей, СЦИсп – 0,15 (0,1; 0,3) относительно 0,07 (0,01; 0,08) у группы сравнения (р₁ > 0,05; р₂ < 0,05)) и индуцированной активности НАДФ-оксидаз (%ФПКст – 19,5 (5,0; 36,8)% против 4,5 (4,0; 7,0)%) у условно-здоровых детей (СЦИст – 0,6 (0,16; 1,1)) относительно 0,17  (0,1; 0,2) у группы сравнения (р_1,2 > 0,05) с сохранением резервного микробицидного потенциала, о чем свидетельствует КМ – 2,1 (2,0; 3,8) (рис. 4).

На основе данных, полученных при сборе анамнеза, и особенностей выявленных дефектов функционирования системы НГ разработана программа таргетной иммуномодулирующей терапии для детей с нетипично протекающей острой деструктивной пневмонией в возрасте от двух до четырех лет, органично включенная в комплексную послеоперационную терапию (рис. 5).

При клиническом анализе использования иммуномодулирующей терапии с включением ГП в комплексном лечении детей двух – четырех лет с нетипично протекающей ОДП были определены положительные эффекты. Так, при поступлении у пациентов преобладали синдромы дыхательной и сердечной недостаточности, а также интоксикационный синдром. В группе исследования нормализация температурной реакции и отсутствие симптомов интоксикации фиксировались к шестым (пятым; седьмым) суткам пребывания в стационаре. Регрессия симптомов дыхательной недостаточности наблюдалась на пятый (четвертый; шестой) день послеоперационного периода, при этом купирование плеврального выпота наблюдалось на восьмые (седьмые; девятые) сутки послеоперационного периода. Наличие послеоперационных осложнений у детей группы исследования не зафиксировано.

Клиническая эффективность проводимой иммуномодулирующей терапии сопровождалась позитивными изменениями иммунологических показателей, характеризующих восстановление эффекторных функций системы НГ. Так, отмечалось увеличение уровня НГ мажорной субпопуляции CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺ до 88,9 (87,2; 90,5)% против 55,77 (35,24; 74,83)%, выявляемых до лечения (р < 0,05). Также отмечались увеличение плотности экспрессии CD16 и CD11b (р_1,2 < 0,05) и тенденция к увеличению MFI CD32 (р > 0,05). При этом было зафиксировано значительное снижение (в 40 раз) минорной CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-субпопуляции НГ до уровня значений условно-здоровых детей на фоне трансформации фенотипа: выявлено увеличение уровня экспрессии CD64 в 2,3 раза (р < 0,05) и CD32 – в 1,4 раза (р < 0,05), снижение MFI CD11b в 1,3 раза в сравнении с показателями до лечения (р > 0,05) с неизмененным MFI CD16 (табл. 1).

Однако не все исследуемые показатели (уровень мажорной субпопуляции и уровень экспрессии CD64 в минорной субпопуляции) восстановились до показателей группы сравнения. Возможно, глубина дефектов функционирования системы НГ у иммунокомпрометированных пациентов требует более длительного курса иммуномодулирующей терапии для полноценного восстановления функционирования ИС.

Анализ показателей фагоцитарной и микробицидной активности НГ выявил: повышение переваривающей активности %П – 55,4 (50,9; 55,7)% против 46,9 (40,7; 49,9)% до лечения; усиление процессов захвата ФЧ – 3,5 (3,4; 3,7) против 2,9 (2,7; 3,3) до лечения (р < 0,05); ФИ – 2,1 (1,7; 2,3) против 1,8 (1,3; 1,9) (р > 0,05) до лечения при неизменяющемся количестве активно фагоцитирующих НГ (%ФАН – 64,0 (61,0; 67,0)% против 60,0 (47,0; 67,0)% до лечения, р > 0,05). При этом восстанавливался баланс НАДФ-оксидаз, регистрируемый в спонтанном NBT-тесте, отмечалось снижение %ФПКсп (3,0 (2,0; 4,0)%, р < 0,05) и СЦИсп (0,11 (0,08; 0,130), р < 0,05) до уровня условно-здоровых детей. В стимулированном NBT-тесте наблюдалась тенденция к снижению показателей %ФПКст (11,5 (8,8; 14,2)%, р > 0,05) и СЦИст (0,34 (0,25; 0,42), р > 0,05), регистрируемых до лечения, с сохранением резервного микробицидного потенциала КМ – 4,7 (4,05; 5,3).

Таким образом, получены позитивные клинико-иммунологические эффекты, демонстрирующие целесообразность использования иммуномодулирующей таргетной терапии с включением ГП в комплексном лечении детей с ОДП.

Обсуждение

Позитивные эффекты ГП обусловлены особенностями связывания ГП с разными мембранными рецепторами НГ, что приводит к активации различных механизмов передачи сигнала, в результате которого наблюдаются перестройка негативно трансформированного фенотипа функционально значимых субпопуляций НГ при ОДП и восстановление эффекторных функций НГ.

В частности, доказано векторное действие ГП на клетки ИС, в том числе на НГ, через никотиновые ацетилхолиновые рецепторы (nAChRs) нейронального типа [23, 24]. Показано модулирование функциональной активности НГ при воздействии на nAChRs НГ в условиях эксперимента in vivo на мышах [25]. Кроме того, ГП (аргинил-альфа-аспартил-лизил-валил-тирозил-аргинин) как синтетический аналог активного центра гормона тимопоэтина может аналогично пентапептиду (аргинил-лизил-аспартил-валил-тирозил) гормона тимуса типопоэтина – тимопентина (ТР5) напрямую связываться с молекулами ГКГС второго типа HLA-DR. Возможность такого связывания показана в экспериментальных исследованиях меченого ТР5 (продемонстрировано прямое связывание флуоресцентно меченного TP5 с HLA-DR) и подтверждена ингибированием немеченым TP5 [26]. Молекулярный анализ дополнил это открытие об изменении сайта связывания в бороздке HLA-DR с валином (Val), который играет роль якоря первого типа, необходимого для связывания TP5 с HLA-DR [26]. Приведенные данные доказывают возможность таргетного иммуномодулирующего воздействия ГП на негативно трансформированные субпопуляции НГ и дефектные эффекторные функции НГ при нетипично протекающих ОДП.

Таким образом, нами показано, что ГП демонстрирует мягкие иммуномодулирующие эффекты, восстанавливая эффекторную фагоцитарную функцию НГ и позитивно изменяя количество и фенотип функционально значимых субпопуляций. Подтвержденные иммунорегуляторные и дезинтоксикационные эффекты препарата Имунофан определяют целесообразность его использования у иммунокомпрометированных детей с ОДП, не отвечающих на стандартную терапию.

Заключение

Накопленный опыт и новые диагностические технологии позволяют детально изучать механизмы возникновения дефектов функционирования НГ при различных нетипично протекающих заболеваниях. Многие внутренние и внешние факторы способствуют возникновению дисфункций НГ, приводящих к повышенной заболеваемости и распространенности тяжелых ГВЗ как у взрослых лиц, так и у детей. ОДП – одно из наиболее тяжелых ГВЗ детского возраста, в лечении которого необходимо сочетать различные терапевтические тактики, направленные на ликвидацию возбудителя, дезинтоксикацию организма, восстановление гомеостаза и в том числе целенаправленную регуляцию иммунного ответа.

С нашей точки зрения, определение негативных трансформаций содержания и фенотипов CD64^-CD16⁺CD32⁺CD11b⁺- и CD64⁺CD16⁺CD32⁺CD11b⁺-субпопуляций НГ при различных нетипично протекающих ГВЗ представляет собой новый диагностический метод для определения полноценного или дефектного участия НГ в воспалительном процессе. При этом необходим подбор иммуномодулирующей терапии направленного действия с целью переориентации негативно трансформированных фенотипов различных субпопуляций НГ, которая могла бы быть включена в комплексное послеоперационное лечение ГВЗ.

Разработанная программа таргетной иммуномодулирующей терапии в комплексном лечении детей с нетипично протекающей ОДП проявила свою высокую клинико-иммунологическую эффективность. Использование ГП в послеоперационном лечении позволило реорганизовать негативные трансформации НГ с восстановлением их функциональной активности. Восстановление функциональной активности и эффекторных функций НГ привело к позитивным клиническим эффектам: раннее купирование интоксикационного синдрома, более ранняя регрессия симптомов дыхательной недостаточности и отсутствие послеоперационных осложнений. Такая динамика способствует сокращению дней пребывания пациента на стационарном лечении, уменьшению продолжительности курсов приема антибактериальных препаратов и сокращению длительности реабилитационного периода.

В связи с вышесказанным включение ГП, являющегося активной субстанцией препарата Имунофан, в послеоперационное лечение детей раннего возраста с ОДП на фоне дисфункций НГ клинически и иммунологически обосновано. 

Финансирование
Исследование выполнено в рамках государственного задания Министерства здравоохранения Российской Федерации № 121031000071-4.