Использование лазерной допплеровской флоуметрии и флуоресцентной спектроскопии для оценки состояния микроциркуляторного русла и тканевого метаболизма у больных сахарным диабетом 2 типа на фоне терапии препаратом Субетта

Таблица 1. Контрольные значения диагностических величин при применении ЛДФ

Рис. 1. Нормальная микроциркуляция

Рис. 2. Повышенная микроциркуляция

Рис. 3. Сниженная микроциркуляция

Таблица 2. Контрольные показатели окислительного метаболизма и резервов метаболизма

Рис. 4. Амплитуды флуоресценции НАДН

Рис. 5. Амплитуда флуоресценции ФАД

Рис. 6. Показатель микроциркуляции до добавления препарата Субетта

Рис. 7. Показатель микроциркуляции после добавления препарата Субетта

Согласно данным экспертов Международной федерации диабета (International Diabetes Federation – IDF) и Американской диабетической ассоциации, количество пациентов с сахарным диабетом (СД) за последние десять лет увеличилось более чем в два раза. Столь стремительный рост заболеваемости стал причиной принятия в 2006 г. Организацией Объединенных Наций резолюции о сахарном диабете [1], а в 2011 г. – политической декларации [2], призывающей создавать многопрофильные стратегии для профилактики развития неинфекционных заболеваний и борьбы с ними, в частности в отношении СД, осложнения которого являются одной из ведущих причин инвалидизации и смерти [3, 4].

В 2017 г. численность больных СД превысила 425 млн. Согласно прогнозам IDF, к 2045 г. СД будут страдать 629 млн человек [5].

В Российской Федерации, так же как во всем мире, отмечается возрастание заболеваемости СД. Согласно данным федерального регистра СД, в 2018 г. на диспансерном учете находилось 4 584 575 человек (3,1% населения). Из них 4 238 503 (92%) – с СД 2 типа, 256 202 (6%) – с СД 1 типа и 89 870 (2%) – с другими типами СД, в том числе 8006 с гестационным. Однако эти данные не отражают реального количества пациентов, поскольку учитывают только выявленные и зарегистрированные случаи. Так, результаты масштабного российского эпидемиологического исследования NATION подтверждают, что диагностируется лишь 54% случаев СД 2 типа. Реальное количество больных в России – не менее 9 млн (около 6% населения). В долгосрочной перспективе это может представлять чрезвычайную проблему. Поскольку у значительной части пациентов СД остается недиагностированным, они не получают лечения и высок риск развития сосудистых осложнений [6–11].

Инсулинорезистентность и ее роль в развитии эндотелиальной дисфункции

Изменения на любом из этапов внутриклеточной сигнальной трансдукции инсулина могут стать причиной инсулинорезистентности на молекулярном уровне.

Инсулинорезистентность – нарушение биологического ответа (метаболического и молекулярно-генетического) на экзогенный и эндогенный инсулин, метаболизма углеводов, жиров и белков, а также синтеза ДНК, регуляции транскрипции генов, процессов дифференцировки и роста клеток и тканей организма [12]. В инициации инсулинорезистентности большое значение отводится пострецепторным нарушениям передачи сигнала инсулина, обусловленным, вероятно, повышением уровня фактора некроза опухоли α, неэтерифицированных жирных кислот, малоподвижным образом жизни, высококалорийной диетой, возрастом, курением, избыточным весом/ожирением и др. [13]. Причинами инсулинорезистентности клеток поперечнополосатых мышц могут быть дефекты транспорта глюкозы, обусловленные патологией глюкозного транспортера 4 [14].

Инсулинорезистентность признана одной из главных причин развития эндотелиальной дисфункции, приводящей к развитию сердечно-сосудистых заболеваний и их осложнений [8, 12, 15].

Микро- и макроциркуляторные нарушения, которые зачастую формируются незаметно, значительно снижают качество жизни больных и могут стать причиной преждевременной смерти.

Микроциркуляция изменяется задолго до клинических проявлений сахарного диабета. Именно она играет центральную роль в формировании синдрома диабетической стопы – одного из поздних осложнений СД [15–19].

В этой связи представляется неоспоримым потенциал комбинированной, одновременной оценки перфузии крови в системе микроциркуляции с помощью лазерной допплеровской флоуметрии (ЛДФ) и окислительного метаболизма с помощью лазерной флуоресцентной спектроскопии (ЛФС). Окислительный метаболизм определяется по таким биомаркерам-коферментам, как окисленный флавинадениндинуклеотид (ФАД) и восстановленный никотинамидадениндинуклеотид (НАДН). Сочетание указанных методов диагностики позволяет установить риск развития нарушений со стороны микроциркуляторного русла и тканевого метаболизма [20].

Система микроциркуляции

Система микроциркуляции – одна из важных систем, по состоянию которой можно выявлять болезни на ранних стадиях. Необходимо отметить, что нарушение микроциркуляции может быть не только вторичным, но и первичным, то есть обусловливать развитие ряда заболеваний и определять их исход. С теми или иными нарушениями отдельных звеньев микроциркуляции связано развитие атеросклероза, артериальной гипертензии, эндотоксемии и сепсиса, диабетической нефропатии, венозной недостаточности, диабетической ангиопатии нижних конечностей [21].

Мониторирование микроциркуляторной функции в клинике ограниченно как из-за небольшого числа безопасных методов, так и из-за сложности интерпретации данных [21].

В отличие от других методов ЛДФ является безопасным способом оценки микроциркуляторной функции нижних конечностей, поскольку параметры кровотока определяются неинвазивно. С помощью ЛДФ можно исследовать такие звенья гемомикроциркуляторного русла, как артериолы, терминальные артериолы, капилляры, посткапиллярные венулы, венулы и артериоло-венулярные анастомозы [22–24].

В таблице 1 приведены контрольные значения диагностических величин состояния микроциркуляции, исследованной на подошвенной области большого пальца ноги здоровых лиц с помощью ЛДФ.

Примеры исследования микроциркуляции представлены на рис. 1–3.

Окислительный метаболизм

Митохондриальный стресс (нарушение окислительного метаболизма) – основной медиатор нейродегенерации при СД. Высокий уровень глюкозы в тканях обусловливает накопление в митохондриях НАДН. Увеличение доступности электронов и/или насыщенности митохондрий электронами может вызвать парциальное восстановление кислорода до супероксид-анион-радикала в начальной части электронной транспортной цепи. Последующий подъем активных форм кислорода вызывает дегенеративные изменения тканей. Возрастание [Ca²⁺]m в клетках также может увеличить продукцию НАДН энзимами цикла Кребса – пируватдегидрогеназой, изоцитратдегидрогеназой, α-кетоглутаратдегидрогеназой.

Дисбаланс редокс-системы (нарушение соотношения НАДН и НАД), окислительный стресс (образование свободных радикалов) и митохондриальный стресс участвуют в повреждении тканей при СД. Вазодилатация и усиление кровотока – ранние сосудистые реакции на острую гипергликемию и тканевую гипоксию [25, 26].

Регистрировать увеличение концентрации указанных выше коферментов позволяет лазерная флуоресцентная спектроскопия [27].

В таблице 2 приведены контрольные показатели окислительного метаболизма (ПОМ) и резервов метаболизма (РМ).

Показатель окислительного метаболизма рассчитывается по формуле: ПОМ = Мнутр. : (АНАДН + АФАД).

Резерв окислительного метаболизма определяется при проведении температурной пробы. Резервы окислительного метаболизма при нагреве области исследования до 35 °С (РМ⁽⁺⁾) и охлаждении до 10 °С (РМ^(-)) определяются по следующим формулам:

РМ⁽⁺⁾ = (1-(ПОМ(35) - ПОМисх.) : ПОМисх.) × 100%;

РМ^(-) = (1-(ПОМ(10) - ПОМисх.) : ПОМисх.) × 100%,

где   ПОМисх. – показатель окислительного метаболизма в исходном состоянии области исследования;

        ПОМ(35) – показатель окислительного метаболизма при нагреве области исследования до 35 °С;

        ПОМ(10) – показатель окислительного метаболизма при охлаждении области исследования до 10 °С.

Пример динамики амплитуд флуоресценции коферментов приведен на рис. 4 и 5.

Амплитуда коферментов рассчитывается по формулам:

АНАДН = АfНАДН : Аi385;

АФАД = АfФАД : Аi450,

где   Аf – максимум в линии флюоресценции;

        Аi – максимум в линии обратного рассеяния.

По оси ОХ отражается длина волны в нанометрах, по оси ОY – амплитуда флуоресценции в условных единицах, первый подъем – максимум в линии обратного рассеяния (Аi), то есть обратное рассеянное кожей излучение на длине волны генерации лазера, второй подъем – максимум в линии флуоресценции (Аf).

Способы коррекции инсулинорезистентности

Во всех разработанных алгоритмах лечения в качестве препарата выбора для стартовой терапии рекомендован метформин. Однако эта мера лишь частично решает проблему, поскольку влияние метформина на чувствительность мышечной и жировой тканей к инсулину незначительно. Тиазолидиндионы благодаря уникальному механизму действия превосходят в этом метформин. Снижая нагрузку на β-клетки, они способствуют длительному сохранению их способности секретировать инсулин. Однако публикация S.E. Nissen и соавт. «Effect of rosiglitazone on the risk of myocardial infarction and death from cardiovascular causes» («Влияние росиглитазона на риск развития инфаркта миокарда и смерти от сердечно-сосудистых причин») (2007 г.), представляющая собой метаанализ данных 42 рандомизированных клинических исследований, всколыхнула медицинское сообщество [28]. Приведенные в ней результаты стали основанием для Управления по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США ввести новые беспрецедентные требования к доказательной базе в отношении безопасности гипогликемических препаратов. В сентябре 2010 г. Европейское медицинское агентство рекомендовало приостановить продажу росиглитазона в Европе. До истории с росиглитазоном в 2000 г. был отозван еще один представитель данной группы препаратов – троглитазон – из-за высокой гепатотоксичности. Это стало поводом для проявления настороженности и в отношении пиоглитазона [12].

В связи с вышесказанным существует потребность в препаратах, влияющих на инсулинорезистентность.

В 2010 г. на отечественном фармацевтическом рынке появился новый препарат Субетта (ООО «Научно-производственная фирма „Материа Медика Холдинг“»).

Субетта – комплексный препарат, созданный на основе технологически обработанных антител в сверхвысоких разведениях к β-субъединице рецептора инсулина и антител к эндотелиальной NO-синтазе (анти-eNOS). В отличие от высоких концентраций антител, связывающихся с антигенами и блокирующих их, уникальная технология высокого разведения позволяет получить антитела, которые не блокируют молекулы-мишени, а через конформационные изменения регулируют их функцию и биологические эффекты [29, 30]. Изменяя конформацию β-субъединицы инсулинового рецептора, препарат активирует его: повышает соотношение активированных форм β-субъединиц инсулинового рецептора к общим формам [30] и продукцию адипонектина адипоцитами [31], стимулирует индуцированный инсулином захват глюкозы клетками мышечной ткани [32]. Одновременно препарат модулирует активность eNOS, оказывая терапевтическое воздействие на эндотелиальную дисфункцию [33]. Последняя также ассоциируется с инсулинорезистентностью. Эндотелиальная дисфункция способствует прогрессированию СД 2 типа и его сосудистых осложнений [33].

Цель исследования

Изучить динамику состояния микроциркуляторного русла и тканевого метаболизма (по динамике коферментов ФАД и НАДН) с помощью лазерной допплеровской флуометрии и лазерной флуоресцентной спектроскопии у больных сахарным диабетом 2 типа на фоне приема только метформина и в комбинации с препаратом Субетта.

Материал и методы

Обследовано 16 пациентов с СД 2 типа (11 женщин и пять мужчин) в возрасте 49–70 лет с уровнем гликированного гемоглобина 6,5–7,5%.

Помимо общепринятых методов исследования, таких как оценка общего статуса, биохимического и клинического анализа крови, гликированного гемоглобина, глюкозы крови в течение суток, ультразвукового исследования, реовазографии, с помощью ЛДФ и ЛФС изучались микроциркуляция (М) и тканевый метаболизм соответственно.

Для сочетанного применения ЛДФ и ЛФС использовали аппарат лазерный диагностический «ЛАЗМА СТ» (регистрационное удостоверение Росздравнадзора № РЗН 2017/5844 от 08.06.2017). Проводились тепловая (местное нагревание до 35 °С) и холодовая (местное охлаждение до 10 °С) пробы, позволяющие выявить резервные возможности тканевого метаболизма и, следовательно, раннее нарушение микроциркуляции.

Контрольные значения диагностических величин при применении ЛДФ представлены в табл. 1.

Показатели окислительного метаболизма и резервов метаболизма (РМ⁽⁺⁾ и РМ^(-)), соответствующие норме, представлены в табл. 2.

Исследование проводилось на подошвенной части большого пальца стопы. Данная область предварительно обрабатывалась спиртовым раствором. Исследование предполагало несколько этапов:

регистрация исходной температуры исследуемой области на панели «ЛАЗМА-ТЕСТ» в окне программы. Регистрация записи кровотока и лимфотока, амплитуды флуоресценции НАДН в течение четырех минут (ультрафиолетный спектр) и амплитуды флуоресценции ФАД также в течение четырех минут (синий спектр), общая длительность исследования – восемь минут;

• охлаждение области исследования до 10 °С. Контроль охлаждения по данным на панели «ЛАЗМА-ТЕСТ»;
• регистрация записи кровотока и лимфотока при 10 °С, спектров флуоресценции НАДН в течение 30 секунд (ультрафиолетный спектр) и ФАД в течение 30 секунд (синий спектр). Длительность исследования – одна минута;
• нагрев области исследования до 35 °С. Контроль нагрева по данным на панели «ЛАЗМА-ТЕСТ»;
• регистрация кровотока и лимфотока при 35 °С, спектров флуоресценции НАДН в течение двух минут (ультрафиолетный спектр) и ФАД в течение двух минут (синий спектр). Общая длительность исследования – четыре минуты.

Пациенты были разделены на две группы, сопоставимые по полу и возрасту, уровню гликированного гемоглобина.

Первую, контрольную, группу составили десять больных (семь женщин и трое мужчин). Они принимали метформин в дозе 2000 мг/сут (утром и вечером).

Вторая группа включала шесть пациентов (четыре женщины и двое мужчин). В дополнение к метформину в той же суточной дозе они принимали препарат Субетта. Препарат Субетта назначался два раза в день (по две таблетки для рассасывания).

Критерии включения в исследование:

• СД 2 типа;
• уровень гликированного гемоглобина от 6,5 до 7,5%.

Критерии невключения:

• наличие нарушений магистрального кровотока сосудов нижних конечностей;
• грибковое поражение;
• тяжелые соматические заболевания;
• онкология;
• беременность,
• прием других сахароснижающих препаратов, кроме метформина.

Оценка микроциркуляции и тканевого метаболизма проводилась в начале исследования и через три месяца. Определяли микроциркуляцию в перфузных единицах, ПОМ в относительных единицах.

Результаты

За время наблюдения общее состояние больных удовлетворительное, изменений со стороны клинических показателей крови и биохимических показателей состояния печени не отмечено, снижение гликированного гемоглобина на 0,4–0,7%, триглицеридов с 5,6 до 3,2 мкмоль/л.

В первой группе значимых изменений М, ПОМ и снижения РМ⁽⁺⁾ выявлено не было, что свидетельствовало об отсутствии улучшения активности метаболизма.

Во второй группе у четырех пациентов из шести повысились М, ПОМ и снизился РМ⁽⁺⁾, что соответствовало улучшению активности метаболизма.

Пациент 1. М исходно – 17,64, через 12 месяцев – 22,20, ПОМ – 2,29 и 6,14, РМ^(-) – -85,60 и -32,91, РМ⁽⁺⁾ – 122,0 и 7,8 соответственно.

Пациент 2. М исходно 7,09, через 12 месяцев – 22,10, ПОМ – 0,30 и 3,07, РМ^(-) – -53,22 и -40,80, РМ⁽⁺⁾ – 580 и 17 соответственно.

Пациент 3. М исходно – 12,31, после терапии Субеттой – 16,10, ПОМ – 0,37 и 1,69, РМ^(-) – -5,15 и -46,81, РМ⁽⁺⁾ – 213 и 130 соответственно.

Пациент 4. М до терапии препаратом Субетта – 7,00, после лечения – 14,00, ПОМ – 0,47 и 2,47, РМ^(-) – -45,20 и -77,43, РМ⁽⁺⁾ – 387 и 141 соответственно.

В качестве примера приведем более полные данные пациента 3. У больного до терапии практически отсутствовала реакция на холодовую пробу – низкое значение РМ^(-) – -5,15. После терапии препаратом Субетта отмечался значительный прирост РМ^(-) – -46,81, что свидетельствовало об улучшении микроциркуляторно-тканевых систем. Улучшились также показатели М – с 12,31 до 16,10 (рис. 6 и 7), ПОМ – с 0,37 до 1,69, РМ⁽⁺⁾ – снижение с 213 до 130.

Зафиксирована положительная динамика уровня триглицеридов – снижение с 5,6 до 3,2 мкмоль/л, гликированного гемоглобина – уменьшение на 0,4%.

За время исследования каких-либо побочных явлений у больных, получавших препарат Субетта, не отмечено.

Вывод

Комплексное использование ЛДФ и ЛФС позволяет неинвазивно, безопасно определять состояние микроциркуляторного русла и окислительного метаболизма у пациентов с сахарным диабетом. Речь, в частности, идет об оценке динамики коферментов энергетического метаболизма и микроциркуляции при проведении функциональных проб (холодовой и тепловой). Проведение функциональной холодовой и тепловой проб помогает установить резервные возможности энергетического метаболизма.

Терапия метформином в сочетании с препаратом Субетта в течение трех месяцев способствовала улучшению состояния микроциркуляторно-тканевой системы. Показатели М и ПОМ увеличились, РМ⁽⁺⁾ снизились.

Назначение комбинации метформина и препарата Субетта привело к более выраженным гипогликемическим эффектам. Так, уровень гликированного гемоглобина в среднем снизился на 0,4%.

Длительное применение указанных препаратов не сопровождалось развитием таких побочных эффектов, как гипогликемия, ацидоз, повышение массы тела.