Изменение экспрессии гена S100А8 под воздействием лазерного излучения низкой интенсивности у больных псориазом

Рис. 1. Уровень экспрессии мРНК гена S100А8 в пораженной коже по отношению к таковому в визуально не пораженной псориазом коже

Рис. 2. Сравнение уровня экспрессии гена S100А8 с помощью непараметрического метода Манна – Уитни в образцах пораженной псориазом кожи до и после лечения низкоинтенсивным лазерным излучением

Введение

Псориаз – распространенное хроническое воспалительное заболевание кожи, которым страдает до 3% населения Земли [1]. Кожное поражение проявляется в виде чешуйчатой множественной эритемы на лице, волосистой части головы, туловище, верхних и нижних конечностях. Патология ассоциируется со значительной физической и психологической нагрузкой на больных, что неизбежно приводит к снижению качества их жизни [2]. Псориаз часто сочетается с такими системными заболеваниями, как сахарный диабет 2 типа [3], артериальная гипертензия [4], ожирение [5] и сердечно-сосудистая патология [6]. В ряде ретроспективных исследований отмечена связь психических расстройств и патологической тревожности с псориазом [7–10].

Активное изучение генов, вовлеченных в псориатический процесс, позволило лучше понять патогенез псориаза. Этому способствовал анализ полиморфных вариантов, функциональной активности генов [11–14].

Установлено, что S100-белки представляют собой кальций-связывающие белки, расположенные в локусе 4 восприимчивости к псориазу. Они высоко экспрессируются в эпидермисе при псориазе и являются потенциальными медиаторами псориаза [15, 16].

Гены S100А8 и S100А9 преимущественно экспрессируются эпителиальными клетками миелоидного происхождения и кератиноцитами при воспалительных процессах. Белок S100А8/S100А9 играет важную роль в миелоидной дифференциации, воспалении и проявляет антимикробную активность. Комплекс S100A8–S100A9 приводит к неконтролируемой активации иммунных клеток, ангиогенезу, гиперпролиферации кератиноцитов и, наконец, к хроническому воспалению, которое типично для псориаза [17].

Целью настоящего исследования стала оценка изменения уровня экспрессии гена S100А8 в пораженной псориазом коже по сравнению с непораженной до и после лечения лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм.

Материал и методы

Исследование одобрено Локальным комитетом по этике при Центре теоретических проблем физико-химической фармакологии Российской академии наук. Оно также соответствует принципам, изложенным в декларации Хельсинкского соглашения.

Забор материала для биопсии осуществлялся у 12 пациентов с диагнозом «бляшечный псориаз» (Psoriasis vulgaris). Все они проходили лечение в клинике им. В.Г. Короленко Московского научно-практического центра дерматовенерологии и косметологии.

Средний возраст больных – 43,5 ± 8,8 года, тяжесть заболевания по Psoriasis Area and Severity Index (PASI) – 22,10 ± 6,25 балла.

Диагноз устанавливался клинически и подтверждался результатами патоморфологического исследования биоптата кожи.

Забор пораженного и непораженного участков кожи проводили под местной анестезией с помощью дерматологического пробойника (4 мм). Кожу для биопсии с непораженных участков брали на расстоянии 3 см от пораженных.

Выделение РНК из биопсий проводили на колонках Qiagen по стандартному протоколу RNeasy Mini Kit® для кожи. Для освобождения препаратов РНК от примесей ДНК проводили обработку ДНКазой Qiagen. Концентрацию РНК измеряли на спектрофотометре NanoDrop 1000 (Thermo Scientific, США), после чего образцы выравнивали по концентрации в ddH₂O.

Далее в пробирки для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) объемом 200 мкл вносили буфер, dNTP, 100 единиц обратной транскриптазы M_MLV (Promega), 20 единиц ингибитора РНКаз RNasin (Promega), 500 нг oligo(dT) праймеров («ДНК-Синтез») и РНК до конечной концентрации не более 100 нг/мкл. Смесь термостатировали один час при 37 °С.

ПЦР в режиме реального времени проводили в 96-луночных оптических плашках с использованием интеркалирующего красителя SYBR Green («Евроген», Россия). Праймеры и пробы были синтезированы фирмой «ДНК-Синтез».

Амплификацию в ПЦР-амплификаторе (Bio-Rad, CFX96™) проводили поэтапно:

• денатурация при 95 °С в течение четырех минут;
• денатурация при 94 °С в течение 15 секунд;
• отжиг при 55 °С в течение 15 секунд;
• элонгация при 72 °С в течение 15 секунд;
• повторение этапов со второго по четвертый 35 раз.

Экспрессию генов-мишеней нормализовали на ген домашнего хозяйства GAPDH.

Амплификация гена GAPDH и исследуемых генов проводилась в разных пробирках.

Результаты ПЦР обрабатывали с помощью метода 2^-ΔΔCt [18].

Результаты

На первом этапе проведена оценка уровня экспрессии гена S100А8 на пораженном участке коже по сравнению с таковым на визуально непораженном участке. Всего были проанализированы 24 биопсии, взятые у 12 больных.

У всех пациентов уровень экспрессии гена S100А8 в зоне поражения был выше, чем в непораженной области. При этом значения увеличивались от 16,21 (12-й пациент) до 307,96 (пятый пациент) раза (рис. 1). В среднем экспрессия гена S100А8 у пациентов оказалась повышенной в 112,86 ± 23,95 раза.

На втором этапе проводилось лечение больных псориазом лазерным излучением низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм (коротковолновая часть инфракрасного диапазона).

По завершении терапии у всех пациентов наблюдалась полная ремиссия. Субъективные жалобы отсутствовали.

Переносимость лечения оценивалась как хорошая и очень хорошая. Каких-либо нежелательных явлений не зафиксировано.

После окончания терапии проведен повторный забор биопсий (24 штуки) из визуально пораженных и непораженных участков кожи. Затем оценена динамика уровня экспрессии гена S100А8 в пораженной и не пораженной псориазом коже до и после лечения.

У всех пациентов наблюдалось достоверное снижение экспрессии гена S100А8 – до 20,23 ± 5,69 раза (p < 0,05) (рис. 2).

Заключение

Установлено, что в пораженной псориазом коже происходит дефектная активация экспрессии гена S100А8. Это может поддерживать повреждающий кожу иммуновоспалительный ответ.

Согласно полученным результатам, лазерное излучение низкой интенсивности с длиной волны 1,27 мкм положительно влияет на кожный процесс при псориазе. Эффективность лечения подтверждена и на клиническом, и на молекулярном уровне. Так, у больных псориазом экспрессия S100А8 значительно снизилась.

Полагаем, что транскрипционную активность гена S100А8 можно рассматривать в качестве потенциальной терапевтической мишени при псориазе и маркера эффективности лечения. 

Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.