Клинико-патогенетические особенности разных гистотипов миомы матки и пути их фармакологической коррекции

Таблица 1. Оценка интенсивности иммуногистохимических реакций

В частности: следует ли удалять диагностированные миоматозные узлы небольших размеров с помощью миомэктомии или осуществлять консервативное наблюдение, рекомендовать ли беременность, которая, по данным ряда авторов, стабилизирует размеры опухоли и даже способствует ее регрессии (6, 7). Неясно, почему при низкой митотической активности может наблюдаться истинный рост миомы матки, в основе которого лежат процессы гиперплазии и гипертрофии миоцитов.

По поводу миомы матки выполняется до 50-70% оперативных вмешательств в гинекологических стационарах, из которых 60,9-95,5% приходится на радикальные операции, в том числе и в репродуктивном возрасте (24-26,8%), когда предпочтительными должны быть органосохраняющие методы лечения.

При выборе тактики лечения в настоящее время недостаточно учитывается гистологический тип лейомиомы матки (Лм). Одной из проблем является различная интерпретация авторами морфологических особенностей при гистологическом исследовании миомы матки, в связи с чем в руководствах представлены различные классификации. ВОЗ рекомендует выделять Лм, которую в отечественной литературе часто обозначают как простую или обычную Лм (11), и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т. д.) (World Health Organization Classification of Tumors, ВОЗ, 2003). Известно, что разные гистологические типы Лм обладают различным пролиферативным потенциалом и вследствие этого могут требовать разного тактического подхода к лечению.

В последнее время широко обсуждается вопрос о роли и значении стромального компонента в развитии опухолевого процесса (1, 9). Однако в современной литературе недостаточно работ по определению характера, количества и морфологических особенностей стромального компонента при различных типах миомы матки (9). Практически отсутствуют данные о молекулярно-биологических особенностях процессов апоптоза, пролиферации, неоангио­генеза и экспресии факторов роста, отражающих ремоделирование стромы в миоме матки (3, 4). Между тем, эти данные позволили бы вплотную приблизиться к решению проблемы органосохраняющей терапии при миоме матки.

Цель исследования

На основании выявления клинико-морфологических особенностей и ремоделирования стромального компонента миомы матки определить пути фармакологической коррекции.

Методы исследования

Для решения поставленных задач в настоящее исследование были включены 160 больных с миомой матки, находившиеся на стационарном лечении (с 2002 года по 2004-й год) в гинекологическом отделении ГКБ № 40 г. Москвы, являющегося базой кафедры акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова.

В процессе обследования изучаемых больных применялся комплекс диагностических методик: анамнестические, клинико-гинекологическое обследование, учитывались биохимические, гемостазиологические и другие лабораторные показатели. Ультразвуковое исследование органов малого таза производили с помощью аппарата Acuson 128 ХР 10. Цветовое допплеровское картирование производили в области сосудистых пучков матки с обеих сторон, а также исследовали состояние миометрия и эндометрия.

Углубленные морфологические и иммуногистохимические исследования выполнены на кафедре патологической анатомии ММА им. И.М. Сеченова под руководством профессора кафедры Е.А. Коган. При морфологическом исследовании изучался макропрепарат (удаленная матка и миоматозные узлы). Проводилось гистологическое исследование парафиновых срезов с окрасками гематоксилином и эозином и пикрофуксином по Ван Гизону. Иммуногистохимические реакции ставились по общепринятой методикe с демаскировкой антигенов в СВЧ печи на серийных парафиновых срезах из лейомиоматозных узлов, миометрия и эндометрия женщин. В качестве первичных специфических антител использовались моноклональные антитела к следующим антигенам: Ki–67 (Dianova) – маркер пролиферации; PCNA (Novocastra) – маркер пролиферации; C-myc (Novocastra) – фактор клеточного деления; Bcl-2 (Dako) – антиапоптотический клеточный онкоген; CD-95 – проапоптотический фактор; Bax (Calbiochem) – проапоптотический онкопротеин; FGF β – фактор роста фибробластов; CD – 34 – маркер неоангиогенеза; EGF (Santa Cruz Biotechnology) – эпидермальный фактор роста; EGFR (Santa Cruz Biotechnology) – рецептор к эпидермальному фактору росту; IGF (Pepro Tech EC LTD) – инсулиноподобный фактор роста; TGFβ (Calbiochem) – тромбоцитарный фактор роста; Ламинину и Фибронектину – компонентам экстрацеллюлярного матрикса.

В качестве вторичных антител и визуализирующей системы применялся стрептавидиновый комплекс (LSAB KIT (DAKO)). Ставился отрицательный контроль реакции на срезах без специфических первичных антител. В качестве положительного контроля использовался мелкоклеточный рак легкого человека (с известной экспрессией маркеров). Результаты иммуногистохимических реакции для C-myc, Bcl-2; Bax, CD – 95, FGF, CD–34, EGF, EGFR, IGF, TGFβ оценивались в баллах полуколичественным методом по проценту окрашенных клеток, следуя нижеприведенной схеме (таблица 1).

 Оценка экспрессии Кi–67 и PCNA проводилась путем подсчета процента окрашенных ядер на 3000 клеток. Апоптоз оценивали с помощью Tunel-метода in situ labeling hybridization (ENZO ApopDETEK Cell Death Assay System). Результаты апоптоза представлены в виде процента выявленных апоптозных телец на 3000 клеток с вычислением среднего арифметического и стандартного отклонения. Статистическую обработку результатов осуществляли с помощью программы Epi Info 5.0.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Ретроспективно на основании результатов морфологического исследования все наблюдения были разделены на группы с простыми, клеточными и митотически активными миомами матки (по классификации ВОЗ, 2003, World Health Organization Classification of Tumors).

Распределение обследованных больных по группам оказалось следующим: 67 пациенток с простой миомой матки составили первую группу; 44 больных с клеточной миомой – вторую и 49 женщин с митотически активной миомой отнесли к третьей группе.

В позднем репродуктивном периоде оказались 24 (15%) пациенток I группы, 15 (9,4%) - II группы и 10 (6,3%) женщин III группы. В пременопаузальном периоде находились 21 (13,1%) больная из первой группы, 14 (8,7%) – из второй группы и 28 (17,5%) наблюдений с митотически активной миомой матки. В постменопаузальном периоде из группы женщин с простой миомой оказалось 22 (13,8%) пациентки, из второй группы – 15 (9,4%) женщин и из третьей группы – 11 (6,8%) больных.

Результаты анализа данных о количестве и локализации миоматозных узлов при новообразованиях миометрия свидетельствуют, что подавляющее большинство – 52 (77,6%) пациенток с простой миомой матки имели 1-2 миоматозных узла небольших размеров, в то время как у 20 (45,4%) больных с клеточной и 38 (77,5%) женщин с митотически активной миомой матки обнаружены множественные миоматозные узлы больших размеров. Нами выявлены следующие особенности локализации миоматозных узлов при новообразованиях миометрия в зависимости от гистологического вида миомы матки. У больных с простой миомой матки обнаружены миоматозные узлы преимущественно подбрюшинной – 37 (55,2%) и межмышечно-подбрюшинной – 18 (26,9%) локализации. У пациенток с митотически активной миомой матки в подавляющем большинстве наблюдений имел место множественный характер роста: подслизистая – 33 (67,4%) и межмышечная – 36 (73,4%) локализация миоматозных узлов.

На этапе клинического обследования больных обращали особое внимание на жалобы больных и данные анамнеза во всех трех сравниваемых группах. Больные предъявляли, как правило, одновременно по 2-3 жалобы. Следует отметить, что выраженность и интенсивность жалоб преобладала у больных с митотически активной миомой матки по сравнению с клеточной и простой миомой. Основными по частоте жалобами у больных III группы оказались следующие: обильные менструации – 31 (63,3%); длительные менструации – 26 (53,1 %); дизурические симптомы – 25 (55,1%); увеличение живота в объеме – 27 (55,1%).

Характер менструальной функции был различным в зависимости от варианта развития миомы матки. Пациентки с митотически активной и клеточной миомой матки значительно чаще имели нарушения менструальной функции, чем пациентки с простой миомой матки. Наиболее часто встречалась гиперполименорея. Частота дисменореи у больных с митотически активной миомой почти в 3 раза превышала подобную патологию у женщин с простой миомой.

У пациенток с простой миомой матки уровень гемоглобина в большинстве случаев соответствует нормальным показателям или анемии легкой степени, у больных с клеточной миомой матки в 40 (90,7%) наблюдениях показатель гемоглобина оказался ниже 99 г/л, в третьей группе у 31 (63,3%) пациенток гемоглобин был ниже 89 г/л. Наибольшая выраженность анемии у больных с митотически активной миомой матки, вероятно, связана с повышенной экспрессией гепаринсвязывающих факторов роста в данном морфологической варианте миомы.

При анализе структуры гинекологической заболеваемости в зависимости от морфологического варианта миомы матки нами отмечено, что у больных III группы достоверно чаще выявлялись гиперпластические процессы эндометрия – 37(75,5%) и эндометриоз – 43 (87,8%) по сравнению с II и I группой. По-видимому, выявленное нами частое сочетание митотически активной миомы матки с гиперпластическими процессами эндометрия и аденомиозом II-III степени является не случайным, а обусловлено ранее выявленной общностью патогенеза (10).

 Таким образом, проведенный анализ клинических проявлений в трех сравниваемых группах выявил: выраженность и интенсивность жалоб с преобладанием у больных с митотически активной миомой матки по сравнению с клеточной и простой миомой; более выраженную степень анемии у больных с митотически активной и клеточной миомой, связанную с повышенной экспрессией гепаринсвязывающих факторов роста, по сравнению с простой миомой; частое сочетание митотически активной миомы с аденомиозом II-III и гиперпластическими процессами эндометрия.

Все вышеперечисленное позволяет проявлять к женщинам с митотически активной миомой матки и отчасти с клеточной необходимость онкологической настороженности и проводить активную лечебную тактику и соответствующие профилактические мероприятия по отношению к данному типу миомы матки.

Изучались удаленные препараты матки у больных, подвергшихся операции по поводу роста миомы. При макроскопическом исследовании
размеры матки, как правило, были увеличены от 7 до 20 недель беременности. Лейомиомы (Лм) были представлены как одиночными, так и первично-множественными опухолями.

Для установления гистологического типа Лм нами использовалась классификация ВОЗ 2003 г., где выделяется классическая Лм, которая в отечественной литературе часто обозначается как простая или обычная Лм, и ее гистологические варианты (клеточная, митотически активная, эпителиоидная, миксоидная, атипическая Лм и липолейомиома и т. д.) (11).

Простая (обычная, классическая) Лм представлена узлами из плотной беловатой волокнисто-узловатой ткани с четкими границами и чаще в виде единичных узлов. При микроскопическом исследовании простая Лм характеризуется переплетающимися короткими пучками гладкомышечных клеток с выраженными прослойками зрелой соединительной ткани, содержащей большое количество коллагеновых волокон. Строма выражена и представлена в основном компонентами экстрацеллюлярного матрикса со значительным количеством коллагеновых волокон, окрашиваемых по Ван Гизону в красный цвет; фиброцитами и фибробластами, а также небольшим количеством сосудов синусоидного типа, часто со склерозированными стенками. В ткани опухоли отмечаются вторичные изменения в виде отека, очагов некроза, гиалиновой дистрофии и воспалительной инфильтрации.

Клеточные Лм макроскопически представлены узлами из плотной беловатой волокнисто-узловатой ткани с четкими границами и чаще в виде множественных узлов. При микроскопическом исследовании представлены плотно расположенными плохо контурирующимися пучками гипертрофированных лейомиоцитов. В клеточных Лм признаки атипизма клеток и фигуры митозов отсутствуют. Строма клеточных Лм относительно скудна по сравнению с простыми. Она представлена тонкими фиброзными септами и сосудами капиллярного и синусоидного типа. Вторичные изменения незначительны, встречаются редко в виде небольших очагов некроза, гиалиноза, миксоматоза.

 Митотически активная миома макроскопически представлена узлами из плотной беловатой волокнисто-узловатой ткани с четкими границами и чаще в виде множественных узлов. Митотически активные Лм характеризуются наличием гипертрофированных лейомиоцитов и незрелой сосудистой стромы. В отличие от простой и клеточной Лм встречаются фигуры митоза от 5 до 10 в 10 полях зрения при большом увеличении
(х 400). При этом митотическая активность носит очаговый характер и выявляется в виде отдельных очагов пролиферации, локализованных, как правило, вокруг сосудов синусоидного типа, так называемых «зон роста», в которых хорошо различима только эндотелиальная выстилка, а мышечный и адвентициальный слои преобразованы в клеточные скопления (периартериолярные клеточные муфты). Строма слабо выраженная, преобладают сосуды капиллярного и синусоидного типа. Коллагеновые волокна и клетки фибробластического ряда формируют редкие и тонкие пучки в ткани опухоли. Вторичные изменения незначительны, встречаются редко в виде небольших очагов некроза, гиалиноза, миксоматоза. Значительно реже, чем при простой миоме, наблюдаются вторичные изменения в толще узла.

Таким образом, полученные данные показывают, что разные типы Лм отличаются между собой не только паренхиматозным, но и стромальным компонентом. При этом в простых Лм строма зрелая, выраженная с малым количеством сосудов, предрасполагающим к вторичным изменениям. В клеточной и митотически активной Лм строма слабо развита и представлена в основном сосудами капиллярного и синусоидного типов.

Молекулярно-биологические особенности паренхимы при миоме матки изучены детально во многих работах, изучению же стромального компонента уделялось меньше внимания, а его молекулярно-биологические особенности практически не описаны в литературе.

В данном исследовании нами оценена митотическая активность клеток стромы. Средний уровень Ki–67 в простой Лм в строме равен 10,8‰±0,1. Экспрессия Ki–67 в клеточной и митотически активной Лм отмечаемая в строме достоверно выше по сравнению с простой (46,58‰±0,1; 60,98‰±0,2). Митотически активная Лм превосходит клеточную как по количеству очагов пролиферации, так и по среднему показателю уровня экспрессии маркера. Уровень экспрессии PCNA в строме простой миомы составил 20,9‰±0,1, в клеточной – 80,4‰±0,2 , в митотически активной – 91,4‰±0,3.

Полученные результаты показали, что пролиферативная активность по Ki–67 и PCNA невысока и отмечается в основном в строме митотически активных и меньше в клеточных Лм. Однако остаются неясными механизмы гипертрофии и накопления клеток. Для ответа на данные вопросы были исследованы онкопротеины и факторы роста.

Уровень экспрессии Bcl-2 в простой и клеточной миоме матки составил 0,1±0,01. Более высокая экспрессия Bcl-2 в строме наблюдается в митотически активных Лм и составляет 0,8±0,1.

Высокий уровень С-mус отмечен в строме митотических миом матки – 0,45±0,02 . В клеточных и простых Лм показатель С-mус составил 0,1±0,01.

Накопление EGF отмечалось в цитоплазме клеток стромы опухоли и выявлялся не только в Лм, но и в миометрии, в эндотелии сосудов стромы Лм. Более высокая экспрессия EGF обнаружена у пациенток с митотически активными (2,9±0,1) и клеточными (1,4±0,04) по сравнению с простой (1,2±0,03) миомой. Рецептор к EGF выявляется на клеточной мембране, в цитоплазме клеток стромы, эндотелия сосудов стромы Лм. Экспрессия EGFR выражена в таких же цифровых показателях, как и уровни экспрессии EGFR.

Экспрессия фактора роста фибробластов – FGF – максимального значения достигла в митотически активной миоме (2,1±0,02), по сравнению с клеточной (1,5±0,01) и с простой (1,1±0,01).

TGFΒ обнаруживается в цитоплазме клеток стромы и особенно в эндотелии сосудов стромы клеточной и митотически активной Лм, а также в фибробластах простой Лм. Уровень TGFβ во всех типах Лм выше, чем в прилежащем миометрии и эндометрии. В митотически активных (1,4±0,03) TGFβ выше по сравнению с клеточными (1,1±0,02) и простыми (0,62±0,01) Лм. Во всех типах Лм уровень TGFβ больше, чем в миометрии здоровых женщин. Следует отметить, что уровень экспрессии TGFβ максимален у больных с выраженными кровотечениями и при этом накопление этого фактора отмечается в основном в эндотелии сосудистых клеток.

Накопление IGF-1 обнаружено в клетках стромы Лм, эндотелии сосудов Лм, миометрия и эндометрия больных. Отмечена более высокая экспрессия фактора роста во всех типах Лм по сравнению с интактным мио- и эндометрием независимо от гистологического типа опухоли. Уровень IGF-1 у пациенток с митотически активными (1,2±0,03) и клеточными (0,62±0,02) лейомиомами выше по сравнению с уровнем в простой лейомиоме матки (0,13±0,01).

Результаты исследования показали, что в митотически активной и клеточной Лм содержание EGF и его рецептора, TGFβ и IGF-1 выше по сравнению с простой Лм. При этом во всех гистологических типах Лм содержание факторов роста выше, чем в окружающем миометрии. Поэтому, можно предположить, что высокое содержание факторов роста в тканях Лм вносит особый вклад в рост узла. Полученные результаты о низкой пролиферации в простой и клеточной Лм ставит вопрос, за счет каких процессов увеличивается размер опухоли под действием факторов роста. Известно, что IGF-1 является медиатором действия эстрогенов, и в ряде работ было показано, действие EGF, IGF-1 и TGFβ на гипертрофию (12, 13).

Таким образом, рост Лм связан с экспрессией факторов роста (FGF, EGF, TGFβ, IGF-1) онкопротеинов
C-myc, Bcl-2, которые, судя по низкой экспрессии маркеров пролиферации Ki–67 и PCNA, подтверждающих доброкачественный характер опухоли, приводят не столько к пролиферации лейомиоцитов, сколько к их гипертрофии. Максимальный уровень маркеров пролиферации наблюдается в митотически активной Лм и определяет рост данного типа опухоли.

При постановке ApopDETEK теста определяются мелкие коричневого цвета апоптозные тельца, напоминающие ядра при кариопикнозе и кариорексисе. Они располагаются чаще вблизи сосудов в простых Лм и в «зонах роста» митотически активных Лм. В группе женщин c митотически активной (3,4‰±0,02) и клеточной Лм (1,6‰±0,05) уровень апоптоза ниже по сравнению с простой Лм (8,8‰±0,06).

В результате проведенных исследований установлено, что в разных гистологических типах Лм отличался и уровень апоптоза. В клеточной и миотически активной Лм наблюдалось достоверное снижение уровня апоптоза по сравнению с простой, тогда как в простой Лм отмечается, наоборот, повышение апоптоза. Вероятно, повышение уровня апоптоза в простых Лм может объяснить их регресс. Снижение уровня апоптоза по сравнению с пролиферацией в митотически активных и клеточных Лм, по всей видимости, играет большую роль, наоборот, в их росте за счет накопления опухолевых клеток.

Экспрессия проапоптотического онкопротеина Bax наблюдалась в цитоплазме стромальных клетках, особенно в эндотелии сосудов. Отмечается повышение уровня Bax в простых Лм (1,1±0,01), по сравнению с клеточными (0,8±0,01) и митотически активными (0,9±0,01) Лм. Результаты экспрессии Bax повторяют тенденцию к повышению апоптоза в простой Лм и его снижению в клеточной и митотически активной Лм.

Локализация очагов пролиферации в околососудистой зоне может указывать, что источником ее являются прогенеторные клетки сосудистой стенки, что подтверждалось при исследовании экспрессии СD-34 – маркера эндотелия и костномозговых стромальных клеток. В узлах миомы матки СD-34 обнаружен не только в эндотелии микрососудов, но и в отдельных клетках сосудистой стенки и периваскулярной ткани. Кроме того, СD-34 выявляли в эндотелии сосудов миометрия и эндометрия. Уровень СD-34 оказался выше в клеточных миомах (12,4±0,1) по сравнению с простыми миомами (5,2±0,1), максимального значения показатель СD-34 достиг в митотически активных лейомиомах (30,8±0,2), что свидетельствовало об усилении процесса неоангиогенеза в активных миомах матки.

Компоненты экстрацеллюлярного матрикса ламинин и фибронектин преобладали в простых миомах (ламинин 4,5±0,1; фибронектин 5,5±0,1) по сравнению с клеточными (ламинин 3,6±0,1; фибронектин 3,7±0,1) и митотически активными (ламинин 3,4±0,1; фибронектин 2,8±0,1).

Таким образом, в зависимости от вида миомы матки стромальный компонент по молекулярно-биологическим особенностям характеризуется: в простой миоме – преобладанием апоптоза над пролиферацией, низким уровнем экспрессии факторов роста и неоангиогенеза; в клеточной – незначительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом; в митотически активной – значительным преобладанием процессов пролиферации над апоптозом, а также выраженным процессом экспрессии факторов роста и нео­ангиогенеза, что и является одним из основных условий роста данной опухоли.

Разные гистологические типы Лм характеризуются особенностями нарушения молекулярно-биологических процессов пролиферации, апоптоза, неоангиогенеза и экспрессии факторов роста в стромальном компоненте опухоли, что обуславливает различия в механизмах их роста и развития.

Обнаруженные нами молекулярно-биологические особенности повышения экспрессии маркеров пролиферации, экспрессии факторов роста и неоангиогенеза, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, а также снижение апоптотической активности в стромальном компоненте миомы матки подводят основу для разработки новых методов лечения, основанных на подавлении процессов неоангиогенеза, пролиферации и индукции апоптоза.

В зарубежных работах встречаются описания двух активных химических соединений (веществ) Indol-3-carbinol и Epigallocatechin-3-Gallate, которые обладают определенным корригирующим влиянием на молекулярно-биологические процессы. В данном аспекте заслуживают внимания синтезированные на основе этих химических соединений препараты – Индинол (Indol-3-carbinol) и Эпигаллат (Epigallocatechin-3-Gallate) (Миракс Фарма) в виду выявленных путей фармакологической коррекции молекулярно-биологических процессов.

Если коротко охарактеризовать функции Индинола, то они могут быть сведены к следующим. Это сильнейший антиэстроген, антиоксидант, лиганд к AhR-рецептору, а также блокатор COX-2, то есть обладающий мощным антипролиферативным свойством фактор (2). Простое перечисление его функций показывает, что его активность распространяется на различные клеточные структуры, и подобное комплексное воздействие на сигнальные пролиферативные пути является уникальным свойством Индинола. Однако спектр активности Индинола не ограничивается перечисленными свойствами. Препарат обладает удивительной способностью избирательно индуцировать в опухолевых клетках эпителиального происхождения процессы программируемой клеточной гибели – апоптоз.

Препарат Эпигаллат оказывает влияние на ряд других молекулярных процессов, а именно: вызывает избирательный апоптоз опухолевых клеток посредством усиления прооксидантной активности; блокадирует неоангиогенез; ингибирует инвазивные процессы при заболеваниях опухолевого и неопухолевого генеза.

В наших исследованиях 59 пациенткам (до или после оперативного вмешательства) проводился курс терапии с использованием препаратов Индинол и Эпигаллат (Миракс Фарма).

С учетом того, что у молодых пациенток с так называемой «наследственной» миомой матки, как правило, имеет место пролиферирующие (клеточные и митотически активные) миоматозные узлы, 35 женщинам с растущей миомой матки проведен
6-месячный курс терапии. Препараты принимали в следующих дозировках: Индинол ежедневно по 100 мг 4 раза в день в сочетании с Эпигаллатом ежедневно по 300 мг 4 раза в день (per os) – в течение 6 месяцев. За время терапии в 94 % случаев не зарегистрировано ни одного случая роста миоматозного узла.

Также принимая во внимание, что при быстрорастущей (митотически активной) миоме матки после консервативной миомэктомии возможен рецидивирующий рост новых узлов, у 24 женщин после операции был проведен 6-месячный курс терапии препаратами Индинол и Эпагаллат (Индинол ежедневно по 100 мг 4 раза в день в сочетании с Эпигаллатом ежедневно по 300 мг 4 раза в день, per os). Заслуживает внимания тот факт, что ни у одной из 24 пациенток в течение года после начала терапии не обнаружен рецидивирующий рост новых узлов.

По-видимому, после более детальных и глубоких исследований по выявлению эффективности средств, влияющих на молекулярные звенья патогенеза, данная группа препаратов займет важное место в арсенале терапевтических методов для консервативного лечения миомы матки.