Перспективы применения комбинированных препаратов лизоцима при COVID-19

Введение

Пандемия коронавирусной инфекции 2019–2021 гг., причиной которой стал коронавирус SARS-CoV-2 (coronavirus disease – 2019 [1]), продолжается уже более 1,5 лет и характеризуется периодическими волнами заболевания во всем мире, что обусловлено высокой мутагенностью и контагиозностью нового РНК-содержащего вируса. Контагиозность характеризуется репродуктивным числом – числом вторичных случаев заражения, вызванных одним инфицированным человеком, и оценивается для коронавируса как 2,2 [2]. Для сравнения: сезонный грипп обычно имеет репродуктивное число около 1,3 [3].

В конце 2019 г. в китайском городе Ухань были выявлены лица с симптомами острого респираторного заболевания, сегодня известного как коронавирусная инфекция – 2019 (СOVID-19). Вирус идентифицирован как бета-коронавирус семейства Coronaviridae и назван SARS-CoV-2 [4]. Он связан с тяжелым острым респираторным синдромом, вызываемым коронавирусом SARS-CoV, высоковирулентен вследствие более интенсивного связывания с ангиотензинпревращающим ферментом – транспортером для вируса в клетку хозяина. Менее чем за два десятилетия этот вирус стал третьим известным коронавирусом, который преодолел межвидовой барьер и вызвал тяжелую респираторную инфекцию у людей после SARS-CoV-1 в 2003 г. и коронавируса ближневосточного респираторного синдрома MERS-CoV, циркулировавшего в 2012 г. Однако SARS-CoV-2 получил беспрецедентное по сравнению с двумя первыми вирусами распространение. Именно из-за быстрого роста числа заболевших и широкого неконтролируемого распространения в мире Всемирная организация здравоохранения объявила пандемию COVID-19 [5]. Быстрое выявление этиологического агента и открытая информация о генетической последовательности вируса сделали доступными диагностические тест-системы на основе полимеразной цепной реакции с его обнаружением в режиме реального времени [6].

Как показала динамика развития пандемии, к вирусу восприимчивы все группы населения. Риск тяжелого течения заболевания наблюдается как у пожилых больных, пациентов с хроническими болезнями, так и у молодых лиц старше 18 лет, что в последнее время объясняется широким распространением новых мутаций – индийского и южноамериканского штаммов коронавируса SARS-CoV-2 (Дельта, Дельта+, Лямбда, Гамма), а также появлением новых штаммов. Большинство клинических случаев (81%) COVID-19 классифицируются как легкие и среднетяжелые. У 14% больных заболевание протекает в тяжелой форме, у 5% – в крайне тяжелой [7].

Коронавирусная инфекция – острое вирусное заболевание, характеризующееся большим полиморфизмом симптоматики с преимущественным поражением верхних отделов дыхательных путей. В случае нетяжелого течения COVID-19 по типу острой респираторной вирусной инфекции заболевание начинается остро, характеризуется наличием умеренно выраженных симптомов интоксикации – лихорадки, усталости, головной и мышечной боли, поражения верхних отделов респираторного тракта, в ряде случаев сопровождается диареей. В настоящее время чаще наблюдается поражение верхних дыхательных путей. Нередко катаральный синдром проявляется першением и болью в горле, кашлем, ринитом, потерей обоняния и вкуса. При осмотре отмечаются гиперемия и отек слизистой оболочки полости носа и задней стенки глотки. У большинства больных на 5–7-й день заболевание завершается выздоровлением. Тем не менее у ряда пациентов, перенесших заболевание в легкой форме, на протяжении нескольких последующих месяцев могут сохраняться симптомы повышенной утомляемости, слабости, потливости, нарушения сна, когнитивные нарушения в виде снижения памяти, внимания, настроения, депрессия, нейромиалгия и др. В 19% случаев развивается тяжелая форма заболевания [7]. Наиболее частым клиническим симптомом при тяжелой форме новой инфекции является пневмония. Кроме того, у значительной части пациентов имеет место респираторный дистресс-синдром.

В связи с обновлением информации о заболевании рекомендуемые схемы лечения COVID-19 часто меняются. В утвержденных на сегодняшний день схемах лечения COVID-19 и рекомендациях Минздрава России от 7 мая 2021 г. [8] (в настоящий момент готовится к выпуску 12-я версия временных методических рекомендаций Минздрава России) при легких формах предусмотрено применение препаратов этиотропной терапии: противовирусных средств и интерферонов-альфа. Имеющиеся сведения о результатах лечения с применением указанных препаратов не позволяют сделать однозначный вывод об их эффективности/неэффективности, безопасности и переносимости. Поэтому их использование допустимо по решению врачебной комиссии, если потенциальная польза для пациента превышает риск развития нежелательных эффектов и состояний. Дополнительно назначается патогенетическая и симптоматическая терапия. При повышении температуры тела более 38,5 °С рекомендуется применение парацетамола, оказывающего жаропонижающее и противовоспалительное действие. При наличии соответствующей симптоматики проводится терапия ринита и ринофарингита, бронхита. Бронхолитическая терапия целесообразна при бронхообструктивном синдроме. В отсутствие противопоказаний пациентам с COVID-19 назначают антикоагулянты в профилактических дозах. На протяжении всего периода лечения рекомендуется употреблять достаточное количество жидкости. Несмотря на наличие современных противовирусных средств, специфических методов терапии COVID-19 не появилось, поэтому рассматривается возможность применения как клинически доступных противовирусных препаратов, так и лекарственных средств разных групп, уже используемых при вирусных заболеваниях, находящихся на клинических и доклинических стадиях исследования эффективности при коронавирусной инфекции.

В качестве средств этиотропной и патогенетической терапии легких форм COVID-19 для снижения лекарственной нагрузки и побочных явлений системных противовирусных препаратов в качестве альтернативы можно рассмотреть применение антисептиков широкого спектра действия с противовирусным эффектом в комбинации со средствами, повышающими местный иммунитет. В данном аспекте перспективным при коронавирусной инфекции представляется препарат Лизобакт Комплит® (АО Босналек, Босния и Герцеговина) в форме дозированного спрея для местного применения. Будучи комбинированным средством, он содержит в своем составе естественный антисептик лизоцим, который не только обладает противовирусным, антибактериальным и противогрибковым эффектами, но и способен усиливать местный иммунитет в случае проникновения вирусов в слизистую оболочку верхних дыхательных путей, антисептик цетилпиридиния хлорид с широким спектром действия и уже подтвержденным in vitro противовирусным действием в отношении инфекции COVID-19 [9], анестетик лидокаин.

С целью изучения противовирусного действия препарата Лизобакт Комплит® в Федеральном научном центре исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН было проведено исследование его действия на культуре клеток, аттестованной для производства вакцин.

Цель исследования – изучить действие препарата Лизобакт Комплит®, в состав которого входят лизоцима гидрохлорид, цетилпиридиния хлорид и лидокаина гидрохлорид, на репродукцию вируса SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero.

Материал и методы

Образцы и их приготовление

Препарат Лизобакт Комплит® использовали в экспериментах без дополнительной подготовки.

Вирусы и клетки

В исследовании использованы клетки Vero (перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки), аттестованные для производства вакцин. Культуру клеток пассировали на питательной среде Игла МЕМ с двойным набором аминокислот и витаминов (2 × ЕMEM) с добавлением 5%-ной фетальной бычьей сыворотки.

В экспериментах применяли штамм ПИК35 вируса атипичной пневмонии 2 SARS-CoV-2 (GISAID ID EPI_ISL_428852), который был выделен на культуре клеток Vero из назофарингеального мазка больного СOVID-19. Вирус выращивали в клетках Vero: штамм прошел четыре последовательных пассажа в культуре клеток. Штамм вызывал цитопатическое поражение клеток. Аликвоты вируса были заморожены и хранились при температуре -80 °С.

Изучение противовирусной активности препарата методом нейтрализации инфекционности к культуре клеток Vero

Для проведения реакции клетки Vero высевали на плоскодонные 96-луночные планшеты (около 10⁵ клеток на лунку) и инкубировали при температуре 37 °С в СО₂-инкубаторе в течение трех дней до достижения полного монослоя.

В круглодонных 96-луночных планшетах на среде ДМЕМ (модифицированная Дульбекко питательная среда ЕМЕМ) готовили серию из восьми двукратных разведений препарата Лизобакт Комплит®, смешивали с 50–200 ТЦД50 штамма вируса SARS-CoV-2 и инкубировали не менее часа при температуре 37 °С в СО2-инкубаторе (ТЦД50 – 50%-ная тканевая цитотоксическая доза или доза вируса, которая вызывает цитопатическое действие (гибель клеток) в 50% тест-объектов). После этого смесь добавляли к монослою клеток Vero. Клетки инкубировали с вирусом при температуре 37 °С в СО₂-инкубаторе. Учет цитопатического действия вируса проводили визуально на пятые сутки после заражения. В каждом эксперименте осуществляли титрование препарата сравнения (положительный контроль), культуральной среды ДМЕМ (отрицательный контроль), а также контрольное титрование дозы вируса. В ходе эксперимента использовали методику, опубликованную ранее [10]. Использование N-гидроксицитидина (N-hydroxycytidine), активность которого изучалась в других экспериментах [11], подтвердило методику проведения данного эксперимента. ИК₅₀ (50%-ная ингибирующая концентрация; концентрация исследуемого соединения, которая ингибирует репродукцию вируса на 50% (при учете по ЦПД)) рассчитывали по формуле Кербера [11].

Результаты

Противовирусную активность препарата Лизобакт Комплит® в культуре клеток Vero изучали методом реакции нейтрализации инфекционности. В эксперименте регистрировалось наличие инфекционного (живого) вируса по его способности размножаться и вызывать гибель клеток (ЦПД), что можно зафиксировать при визуальном осмотре с помощью микроскопа. Противовирусное действие препарата оценивали по способности субстанции ингибировать вирус-индуцированную гибель клеток.

Для заражения использовали тест-штамм ПИК35 вируса SARS-CoV-2 в дозе 56 ТЦД₅₀/лунка. После инкубации зараженных клеток в течение пяти суток визуально оценивали состояние клеток с помощью инвертированного микроскопа. Эксперимент повторяли дважды. Результаты были усреднены и статистически обработаны.

В ходе экспериментов наблюдали отсутствие признаков вирус-индуцированной гибели клеток в лунках с разведением препарата Лизобакт Комплит® до 1:1090. При большем разведении отмечалось появление характерных признаков вирус-индуцированного ЦПД. Установлена зависимость эффекта ингибирования репродукции SARS-CoV-2 от дозы препарата. Это позволило рассчитать 50%-ную ингибирующую концентрацию (ИК₅₀) для препарата Лизобакт Комплит®. По результатам эксперимента, по мере разведения ИК₅₀ препарата составила 1:1090. Таким образом, концентрация препарата многократно (в 1090 раз) превышает ИК₅₀, ингибирующую репродукцию вируса на 50%. Комбинированный препарат Лизобакт Комплит® разрушает оболочку вириона, вирус утрачивает способность заражать клетки и вызывать их гибель. С научной точки зрения перспективным представляется изучение влияния на репродукцию вируса SARS-CoV-2 отдельных компонентов, входящих в состав препарата.

Обсуждение

Вирус внедряется в организм через клетки слизистой оболочки носоглотки и ротоглотки, которые служат входными воротами инфекции. Чтобы заболеть коронавирусной инфекцией, необходимы высокая доза вирусных частиц и/или недостаточность мукозального иммунитета респираторного тракта.

Чем можно объяснить многочисленные случаи бессимптомного носительства и легкого течения болезни? Прежде всего генетически обусловленным, индивидуальным механизмом защиты мукозального иммунитета респираторного тракта, блокирующим проникновение и размножение вируса в клетках слизистой оболочки.

Мукозальный иммунитет оказывает протективное действие на слизистую оболочку посредством микробиома, защитного эпителия, врожденного и приобретенного иммунитета, слизеобразования, кератинизации, слюнообразования [12–14]. Факторами врожденного иммунитета являются фагоциты, интерфероны, система комплемента (NK-клетки, естественные Т-киллеры), антимикробные пептиды: лизоцим, дефензины, лактоферрин, пропердин [13, 15–19]. Адаптивный (приобретенный) иммунитет обеспечивают Т- и В-лимфоциты, иммуноглобулины (Ig) А и G. Одной из причин развития инфекций верхних отделов дыхательных путей, в том числе глотки, является недостаточность мукозального иммунитета [20–26]. В основе недостаточности мукозального иммунитета лежат снижение синтеза секреторного IgA, незрелость иммунных процессов (незавершенность фагоцитоза, низкая способность к синтезу интерферонов), несовершенство барьеров слизистой оболочки, высокая супрессорная активность регуляторных Т-клеток, развитие первичного иммунного ответа с образованием IgM без формирования стойкой памяти [27]. Недостаточность иммунного ответа и отдельных его компонентов приводит к увеличению времени элиминации патогенов, в частности вирусов [20], и развитию заболевания.

Лизоцим – фактор неспецифического (врожденного) иммунитета, содержащийся в слюне, слезах, грудном молоке, секрете дыхательных путей и формирующий неспецифическую защиту [26, 28, 29]. Лизоцима гидрохлорид в составе препарата Лизобакт Комплит® по своему действию, аминокислотной последовательности и молекулярной массе схож с собственным лизоцимом, вырабатываемым в организме человека. Регуляция мукозального иммунитета полости рта, горла и респираторного тракта под действием компонента лизоцима гидрохлорида происходит через образование низкомолекулярных клеточных фрагментов патогенных микроорганизмов – мурамилпептидов и нормализации уровня секреторного иммуноглобулина А (sIgA) [30]. Кроме того, лизоцима гидрохлорид, являясь естественным антисептиком, оказывает широкое противовирусное, противомикробное и противовоспалительное действие, подавляя избыточную активацию макрофагов и нейтрофилов, сдерживая миграцию провоспалительных клеток в очаг воспаления и окислительного стресса, связывая и нейтрализуя внеклеточные медиаторы воспаления [31].

Как уже отмечалось, на развитие инфекции оказывает влияние количество вирусных частиц. Когда их немного, инфекция может или не проявиться, или протекать в легкой форме, при достаточном уровне мукозального иммунитета. Противовирусное действие компонентов, входящих в состав препарата, – лизоцима гидрохлорида и цетилпиридиния хлорида хорошо изучено. Как показывают результаты исследований, лизоцима гидрохлорид, будучи естественным антисептиком, действует на возбудителей воспалительных заболеваний ротоглотки различной этиологии, сохраняя полезную микрофлору [30]. Цетилпиридиния хлорид подавляет активность коронавируса, разрушая его липидную оболочку, что приводит к его уничтожению [9].

Лидокаина гидрохлорид в составе препарата блокирует генерацию и проведение нервных импульсов в чувствительных, двигательных и вегетативных нервных волокнах. Он блокирует мелкие немиелинизированные (ощущение боли) и мелкие миелинизированные (ощущение боли и температуры) волокна, что способствует быстрому купированию боли, затруднений при глотании, отека горла [32].

Настоящее исследование in vitro подтвердило, что препарат Лизобакт Комплит® оказывает противовирусное действие на SARS-CoV-2. Таким образом, Лизобакт Комплит® помогает снизить вирусную нагрузку на слизистую оболочку верхних дыхательных путей, а следовательно, способствует предотвращению прогрессирования заболевания с переходом в более тяжелую форму.

Исходя из изложенного, можно утверждать, что применение препарата Лизобакт Комплит® в первые дни заболевания коронавирусной инфекцией уменьшает вирусную нагрузку на организм, способствует повышению местного иммунитета и соответственно снижает вероятность прогрессирования заболевания. Кроме того, препарат оказывает противовоспалительное и симптоматическое действие при таких симптомах коронавирусной инфекции, как боль и першение в горле. Учитывая, что новый штамм коронавируса SARS-CoV-2 передается от человека человеку в основном воздушно-капельным путем, уменьшение количества вирусных частиц в полости рта и горле с помощью препарата Лизобакт Комплит® потенциально призвано помочь в снижении риска распространения вируса.

Данные о препарате Лизобакт Комплит® с антисептическим, противовирусным и противовоспалительным действием свидетельствуют о том, что его целесообразно применять при легкой степени заболевания, вызванного новой коронавирусной инфекцией, а также в начале заболевания для предотвращения его перехода в более тяжелую форму. Снижение вирусной нагрузки у заболевших в случае контакта с лицами, не имеющими иммунитета к коронавирусу, может способствовать уменьшению заболеваемости.

Препарат Лизобакт Комплит® выпускается в форме дозированного спрея для местного применения, отпускается без рецепта. Переносимость препарата хорошая [33].

Учитывая тенденцию последних месяцев, необходимо отметить, что возраст заболевших снизился. Среди пациентов с легким и бессимптомным течением появилось много детей и подростков до 18 лет, которые могут служить источником инфекции. В этом возрасте вакцинация пока не проводится, также ограничен прием ряда противовирусных препаратов. Перспективным считается дальнейшее исследование воздействия на SARS-CoV-2 препарата Лизобакт® в форме таблеток для рассасывания, которые могут применяться у детей с трех лет.

Выводы

Результаты исследования Федерального научного центра исследований и разработки иммунобиологических препаратов им. М.П. Чумакова РАН подтвердило противовирусную активность препарата Лизобакт Комплит® в отношении вируса SARS-CoV-2 в культуре клеток Vero: действующие концентрации компонентов препарата многократно превышают 50%-ную ингибирующую концентрацию – показатель противовирусной активности.

Применение препарата Лизобакт Комплит® при COVID-19 призвано помочь уменьшить вирусную нагрузку на организм, повысить местный иммунитет, снизить риск прогрессирования заболевания. Благодаря противовоспалительному эффекту препарат Лизобакт Комплит® поможет справиться с болью в горле.

Препарат Лизобакт Комплит®, обладающий антисептическим, противовирусным и противовоспалительным действием, может быть рекомендован для включения в схему комплексной терапии пациентов с COVID-19.