Возможности молекулярно-генетического метода выявления резистентности к кларитромицину и левофлоксацину у Helicobacter pylori

Таблица 1. Критерии оценки чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам

Таблица 2. Частота встречаемости генетических вариантов в генах антибиотикорезистентности H. pylori (S23 rRNA, gyrA)

Рис. 1. Хроматограммы нуклеотидных последовательностей ДНК культур H. pylori, демонстрирующие переходные состояния в гене gyrA

Таблица 3. Сравнение резистентности H. pylori по данным двух методов

Рис. 2. Хроматограмма нуклеотидных последовательностей ДНК культуры H. pylori, демонстрирующая переходные состояния в гене gyrA

Введение

Helicobacter pylori (H. pylori) представляет собой грам­отрицательную бактерию, которой инфицировано около 4,4 млрд человек во всем мире. В развитых странах отмечен тренд на снижение распространенности этой инфекции, что ассоциировано со снижением заболеваемости язвенной болезнью и раком желудка [1]. В Российской Федерации распространенность H. pylori ранее оценивали на уровне 50–92% [2–4], а по последним данным, в России инфицировано около 40% населения [5].

Бактерия H. pylori является основной причиной развития хронического гастрита, язвенной болезни, рака желудка, MALT-лимфомы [6] и других заболеваний [7]. Эрадикационная терапия H. pylori является основным методом лечения этих заболеваний и методом первичной профилактики рака желудка [8].

В недавно опубликованном консенсусе Маастрихт VI в первые предложены две основные стратегии выбора эрадикационной терапии: индивидуализированная – на основе определения чувствительности к антибактериальным препаратам (фенотипическим или молекулярно-генетическим методом) до их назначения, и эмпирическая, с учетом данных о локальной резистентности H. pylori к кларитромицину и мониторинга эффективности схем в регионе [9, 10]. В этой связи возрастает роль молекулярных методов диагностики (в частности, ПЦР в реальном времени, полногеномного секвенирования и цифровой ПЦР) для выявления мутаций H. pylori, связанных с резистентностью к кларитромицину, левофлоксацину, тетрациклину и рифабутину [11].

Показатели устойчивости H. pylori к антибиотикам неуклонно растут во всем мире, что ведет к снижению эффективности схем лечения этой инфекции [12]. Использование макролидных антибиотиков в лечении респираторных заболеваний привело к росту резистентности H. pylori к кларитромицину – основному компоненту тройной терапии первой линии и, соответственно, резкому снижению ее эффективности [13, 14].

В Европе показатели резистентности H. pylori к кларитромицину составляют 18–21,4%, левофлоксацину – 11,0–16,3%, метронидазолу – 39,1–56%. Отмечена значительно большая распространенность в странах Центральной и Южной Европы, чем в странах Северной Европы. В Америке зарегистрирована резистентность к кларитромицину на уровне 10% [15, 16]. В Китае первичная резистентность H. pylori к кларитромицину, метронидазолу и левофлоксацину оценивается на уровне 28,9; 63,8 и 28,0% соответственно. Показатели устойчивости H. pylori аналогичны таковым в Южной Корее [17, 18].

Обобщенный показатель резистентности H. pylori к кларитромицину в Российской Федерации за последние десять лет составил 10,39% (95%-ный доверительный интервал (95% ДИ) 7,103–14,219). По результатам исследований, проведенных в Москве и Московской области, выявлена резистентность H. pylori к кларитромицину на уровне 10,87% (95% ДИ 7,280–15,439), Санкт-Петербурге – 22,26% (95% ДИ 9,525–38,470), Смоленске – 5,74% (95% ДИ 3,511–8,789), Казани – 10,0% (95% ДИ 5,023–17,355). Согласно данным метаанализов [19, 20], уровень резистентности к левофлоксацину cоставил 20%, метронидазолу – 34%, амоксициллину – 1,35%, тетрациклину – 0,98%. Авторы этих метаанализов отметили существенную гетерогенность между включенными исследованиями, ряд из которых был проведен более 10 лет назад, а также различия в применявшихся методиках. Кроме того, данные о низкой резистентности к кларитромицину не подтверждаются сообщениями о недостаточной эффективности стандартной тройной терапии, включающей этот антибиотик. Так, в наблюдательном исследовании «Европейский регистр ведения инфекции Helicobacter pylori» (Hp-EuReg) было показано, что в России в 2013–2018 гг. тройная терапия (ингибиторы протонной помпы, кларитромицин, амоксициллин) назначали в 62,8–68,9% случаев. Эффективность 14-дневной тройной терапии у завершивших прием препаратов (per protocol, PP) составила 85%, при анализе начавших терапию (ITT) – 66% [21]. При этом резистентность к антибиотикам в России составила: 24% к кларитромицину, 27% к левофлоксацину, 29% к метронидазолу, 6% к амоксициллину, 0% к тетрациклину [22].

Устойчивость H. pylori к антибиотикам связана с формированием мутаций или других генетических изменений, которые нарушают механизмы их действия. Большинство случаев первичной резистентности к кларитромицину (около 90% в западных странах) связано с точечными мутациями в гене 23S рРНК, кодирующем пептидилтрансферазу в V домене 23S рРНК, которые приводят к снижению аффинности макролидов к рибосомам бактериальной клетки, тем самым формируя резистентность [23]. Наиболее распространенными, связанными с устойчивостью, мутациями гена 23S рРНК являются A2142G, A2142C и A2143G [24].

Бактерицидное и бактериостатическое действие левофлоксацина обусловлено связыванием с ДНК-гиразами. Функции ДНК-гиразы H. pylori кодируются генами gyrA и gyrB. Резистентность в первую очередь обусловлена несинонимичными мутациями, приводящими к заменам аминокислот в положениях 87 и 91 в белке GyrA [25].

Золотым стандартом в определении чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам являются фенотипические методы: метод разведений в агаре или метод градиентной диффузии. Эти методы позволяют определить минимальную подавляющую концентрацию антибиотика для каждого тестируемого изолята, полученного культуральным методом, и оценить категорию его чувствительности к исследуемому препарату. Однако необходимость выделения чистой культуры H. pylori, методология определения чувствительности с использованием специальных питательных сред и микроаэрофильной атмосферы культивирования, высокие требования к квалификации персонала, большие временные затраты ограничивают применение культуральных методов выделения H. pylori и определения чувствительности к антимикробным препаратам в клинической практике [26].

В настоящее время актуальными в определении чувствительности H. pylori к антибактериальным препаратам являются молекулярно-генетические методы – ПЦР в режиме реального времени. Коммерческие наборы для ПЦР обеспечивают высокую чувствительность (95%) и специфичность (100%) как для выявления H. pylori, так и определения чувствительности к антимикробным препаратам [27]. Такие тесты выполняются быстро (в течение нескольких часов) и не требуют специальных условий транспортировки, в отличие от культурального метода.

Цель исследования – определение чувствительности и специфичности выявления резистентности изолятов H. pylori к кларитромицину и левофлоксацину методом ПЦР.

Материалы и методы

Протестировано 25 образцов чистой культуры H. pylori, у которых уже была определена чувствительность к кларитромицину и левофлоксацину методом серийных разведений в агаре. Фенотипическое определение антибиотикорезистентности штаммов проводили в НИИ антимикробной химиотерапии Смоленского государственного медицинского университета, последующее молекулярно-генетическое определение резистентности выполнено в Московском клиническом научно-практическом центре им. А.С. Логинова. Исследование проводилось вслепую: после того как были установлены аллельные варианты в генах антибио­тикорезистентности, выполняли сравнительный анализ молекулярно-генетических данных с фенотипическими.

Фенотипическую резистентность определяли методом серийных разведений в катионсбалансированном агаре Мюллера – Хинтон (OXOID, Велико­британия) с добавлением бараньей крови (итоговая концентрация 5%) (E&O Laboratories Ltd., Шотландия) в соответствии с рекомендациями Института по клиническим и лабораторным стандартам США (CLSI).

Использовали критерии оценки чувствительности H. pylori к антимикробным препаратам, представленные в табл. 1.

Молекулярно-генетическое определение резистентности проводили путем выявления аллельных вариантов в генах, ответственных за резистентность к кларитромицину – S23 (2142A>C, 2142A>G и 2143A>G) и левофлоксацину – gyrA (87-й кодон 259A>T, 261T/C>G/A и 91-й кодон 271G>A, 271G>T, 272A>G).

ДНК из культур выделяли набором «Проба НК» (ДНК-технология) согласно инструкции производителя. Качество выделенной ДНК оценивали с помощью спектрофотометра Biowave II (Biochrom, США). Определение аллельных вариантов в генах резистентности выполняли методом секвенирования по Сенгеру с использованием собственной разработанной тест-системы на 3500 генетическом анализаторе (Applied biosystems, США).

Результаты

Установлено, что 11 образцов из 25 имели мутации в гене устойчивости к кларитромицину, в 13 образцах зарегистрированы мутации в гене устойчивости к левофлоксацину, шесть образцов имели двойную устойчивость. Генетические варианты в генах резистентности S23, gyrA 25 образцов культур H. pylori представлены в табл. 2.

Стоит отметить, что у некоторых культур было обнаружено состояние перехода от дикого типа к мутантному (рис. 1). Чаще всего состояние перехода наблюдалось в гене gyrA, обусловливающем устойчивость к левофлоксацину.

При сравнении данных о резистентности H. pylori, полученных с помощью молекулярно-генетического метода, с данными фенотипического метода (серийных разведений в агаре) было отмечено, что все
11 культур с фенотипической устойчивостью к кларитромицину имели мутации в гене S23 рРНК.
Из 14 культур с фенотипической резистентностью к левофлоксацину 13 культур имели соответствующие мутации в гене gyrA (табл. 3).

Две культуры H. pylori, у которых были выявлены мутации в гене gyrA, не имели фенотипической резистентности. В одной из них наблюдался переход аллеля дикого типа в мутантный (рис. 2).

Таким образом, чувствительность и специфичность молекулярно-генетического метода определения резистентности к кларитромицину составили 100%, в отношении резистентности к левофлоксацину – 93 и 92% соответственно.

Обсуждение

Данные о резистентности H. pylori к кларитромицину, полученные с помощью молекулярно-генетического тестирования, полностью соответствовали таковым, полученным фенотипическим методом. Все 14 культур с фенотипической резистентностью к кларитромицину имели мутации в гене 23S рРНК. В случае с резистентностью к левофлоксацину результаты тоже вполне убедительные: 13 культур из 14 с фенотипической резистентностью к левофлоксацину имели мутации в гене gyrA. В двух культурах, не имеющих фенотипической резистентности к левофлоксацину, были обнаружены мутации в гене gyrA. Однако в одной из них наблюдалось состояние перехода от дикого типа аллеля к мутантному. Во второй культуре мутация была обнаружена в 87-м кодоне гена gyrA.

Известно, что существуют региональные особенности антибиотикорезистентности H. pylori. Значимость нуклеотидных замен в 87-м кодоне гена gyrA именно для российской популяции еще предстоит уточнить. Возможно, резистентность к левофлоксацину в дополнение к заменам в 87-м, 91-м кодах обусловливают иные варианты данного гена или других генов. Так, в исследовании P. Subsomwong и соавт. (2022) в популяции Мьянмы почти все устойчивые к левофлоксацину изоляты имели аминокислотную замену в положении 91 (Asp-91 на Asn или Tyr) и не имели замен в 87-м кодоне. Однако у устойчивых к левофлоксацину штаммов в соседних с Мьянмой странах Юго-Восточной Азии, таких как Индонезия, Малайзия и Камбоджа, были обнаружены обе мутации [28]. Во многих исследованиях описаны одиночные или двойные мутации в положениях Asn87 и Asp91 как наиболее частые сайты мутаций в резистентных изолятах H. pylori из слизистой оболочки желудка [29–31]. Научные исследования подтверждают, что вариации аминокислот придают устойчивость к антибиотикам в зависимости от географического положения [29, 32, 33].

Исследования резистентности H. pylori к антибиотикам, особенно к кларитромицину и левофлоксацину, приобретают особую значимость при выборе стратегии лечения инфекции H. pylori как при индивидуализированном выборе эрадикационной терапии на основе определения чувствительности к антимикробным препаратам (фенотипическим или молекулярно-генетическим методом) до их назначения, так и для обоснования эмпирической стратегии в регионе, основанной на мониторинге локальной резистентности H. pylori к кларитромицину.

Представленные данные свидетельствуют о высокой диагностической ценности молекулярно-генетического метода, позволяющего быстро и точно определять устойчивость H. pylori к кларитромицину и левофлоксацину. Разработанная тест-система с определением мутаций к кларитромицину S23 (2142A>C, 2142A>G и 2143A>G) и левофлоксацину gyrA (87-й кодон 259A>T, 261T/C>G/A и 91-й кодон 271G>A, 271G>T, 272A>G) обладает высокой чувствительностью и специфичностью. Требуются дальнейшие исследования для определения резистентности к указанным антибиотикам методом ПЦР в биоптатах с контролем фенотипическим методом.