Фармакогенетика – инструмент для оценки прогноза эффективности и безопасности метотрексата

Введение

Улучшение качества и увеличение продолжительности жизни страдающих ревматическими заболеваниями напрямую связаны с достижениями фармакотерапии. Одной из основных проблем лечения является рациональный выбор препарата и его оптимальной дозы, а также контроль эффективности и безопасности. Индивидуальная реакция пациента на лекарственное средство во многом обусловлена генетическими особенностями. Изменение в структуре гена может влиять на белки, участвующие в фармакодинамике и метаболизме препарата. Новое направление клинической фармакологии – фармакогенетика позволяет с помощью генотипирования определить, какой препарат или какая доза являются наиболее эффективными и безопасными.

Метотрексат – цитостатический, базисный противовоспалительный препарат, применяемый при большом количестве ревматических заболеваний. В частности, он признан золотым стандартом для лечения ревматоидного артрита. Он может назначаться как в виде монотерапии, так и в комбинации с глюкокортикостероидами, стандартными базисными противовоспалительными препаратами и генно-инженерными биологическими препаратами.

Метотрексат используют более 0,5 млн пациентов в мире [1]. В России в качестве монотерапии его применяют 58,6% включенных в общероссийский регистр больных ревматоидным артритом [2].

Эффективность метотрексата доказана в большом количестве рандомизированных плацебоконтролируемых исследований и метаанализов таковых. При применении метотрексата отмечается наилучшее соотношение эффективности и токсичности по сравнению с использованием других базисных противовоспалительных препаратов [3]. Согласно результатам исследований, 53% пациентов принимали его более 12 лет. Отмена терапии была связана не с недостаточностью эффекта, а с развитием нежелательных реакций [4].

История изучения и основные механизмы действия

Метотрексат относится к антиметаболитам фолиевой кислоты. Препарат успешно используется в клинической практике с 1948 г., прежде всего в онкологии. Результаты двойных слепых рандомизированных плацебоконтролируемых исследований послужили основанием рекомендовать метотрексат для терапии ревматоидного артрита (США, 1988 г.) [5, 6].

Метотрексат обладает антифолатными свойствами [7]. Это основной механизм его действия. Фармакологическое действие низких (от 10 до 25 мг в неделю) доз, которые используются в ревматологии, связывают с противовоспалительной активностью полиглутаминированных метаболитов [8].

Глутаминированные метаболиты длительное время определяются в тканях, их концентрация в эритроцитах коррелирует с терапевтической эффективностью препарата и зависит от взаимодействия двух ферментов: фолилполиглютаматсинтетазы и его антагониста гамма-глютаматгидролазы. Определение активности этих ферментов прогностически важно для выбора индивидуальной тактики лечения [9].

Теоретически контроль концентрации метотрексата в эритроцитах позволил бы оптимизировать тактику ведения больного, установить целевые показатели внутриклеточной концентрации, спрогнозировать терапевтический эффект. Однако проведенные исследования не выявили закономерности между концентрацией глутаминированных метаболитов в эритроцитах и активностью заболевания или частотой развития нежелательных реакций [10, 11].

На уровень концентрации метотрексата может оказывать влияние уровень экспрессии мембранного белка Р-гликопротеина из семейства ABC-транспортеров, который принимает участие в элиминации фолатов и антифолатов из клетки [12]. Кроме того, установлено, что на фоне низких доз метотрексата повышается высвобождение аденозина. Взаимодействуя со специфическими аденозиновыми рецепторами А2а на поверхности активированных нейтрофилов, он способен оказать существенное противовоспалительное воздействие [13]. Аденозин тормозит активацию и увеличение количества нейтрофилов. В 1983 г. обнаружено, что аденозин способен ингибировать супероксидный анион, продуцируемый нейтрофилами в ответ на действие факторов хемотаксиса (хемоаттрактант N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин) [14]. Еще одно важное свойство аденозина – способность изменять экспрессию молекул адгезии, таких как L-селектин и бета-2-интегрин. Циркулирующие нейтрофилы прилипают к стенкам сосудистого русла, мигрируют через посткапиллярные венулы в зону воспаления, где выступают в качестве потенциальных факторов эндотелиального повреждения, генерируя метаболиты кислорода. Помимо нейтрофилов аденозин воздействует через специфические рецепторы на моноциты и макрофаги, подавляет продукцию провоспалительных цитокинов (интерлейкина 12, фактора некроза опухоли альфа), хемокинов (макрофагального воспалительного протеина альфа) и производных оксида азота. Он также усиливает выработку противовоспалительного интерлейкина 10 и фактора роста эндотелия сосудов [15].

Таким образом, метотрексат обладает антипролиферативным и антивоспалительным эффектом за счет способности ингибировать ряд ключевых ферментов в метаболизме фолата, метионина, аденозина и, как следствие, синтеза ДНК [16].

Фармакогенетика метотрексата

Как было сказано ранее, молекула метотрексата изменяет метаболизм фолиевой кислоты путем взаимодействия с внутриклеточными ферментами. От активности этих ферментов напрямую зависят поступление препарата в клетку, его внутриклеточный метаболизм и скорость выведения из клетки, а следовательно, концентрация препарата, обусловливающая как его эффективность, так и реализацию токсических свойств.

Известно, что помимо взаимодействия с собственными активаторами и ингибиторами на активность ферментов влияют конформационные изменения белковой структуры, в частности структуры активного центра. Последняя зависит от аминокислотной последовательности линейной цепочки, в свою очередь аминокислотный ряд – от полиморфизма генов. Таким образом, любые изменения в генах влияют на метаболизм метотрексата.

Условно все ферменты можно разделить на несколько групп [17]:

• транспортеры, отвечающие за перенос препарата в/из клетки (SLC, ABC);
• ферменты, ответственные за образование активной полиглутаминированной формы (FPGS, GGH);
• фолатного пути (DHFR, MTHFD1, MTHFR, MTR, SHMT1);
• пути синтеза пиримидина (TS);
• пути синтеза пурина (ATIC, GART, GARS, PPAT);
• пути синтеза аденозина (AMPD1, ADA, ADORA2a).

Фармакогенетика ферментов-транспортеров

SLC19A1

SLC19A1, известный как RFC1, представляет собой трансмембранный протеин, ответственный за транспорт фолатов и антифолатов, в частности метотрексата, через клеточную стенку. Этот транспортер экспрессируется в тканях многих органов, особенно в кишечнике, почках и плаценте, что обусловлено их выраженной функцией поглощения [18]. Существует несколько полиморфных вариантов гена SLC19A1. Наиболее изученной мутацией является замена гистидина (G) на аденозин (A) в позиции 80 (rs1051266). В результате этого аргинин заменяется гистидином в кодоне 27 первого трансмембранного домена, обеспечивающего основную функцию фермента [19]. В нескольких исследованиях продемонстрировано влияние полиморфизма rs1051266 на эффективность терапии метотрексатом. Так, группа исследователей из Японии установила, что у больных ревматоидным артритом носительство аллеля G ассоциировалось со снижением активности транспортера, внутриклеточной концентрации метотрексата и, как следствие, эффективности терапии по сравнению с носительством аллеля A [20]. Аналогичные результаты получены в исследовании T. Dervieux и соавт. [21]. Лучший ответ на лечение метотрексатом отмечался у носителей аллеля 80A/A по сравнению с носителями аллеля 80G/G. В то же время в ряде работ зависимость эффективности метотрексата от полиморфизма rs1051266 не выявлена [22, 23]. Данные об ассоциации однонуклеотидного полиморфизма rs101266 с развитием нежелательных реакций противоречивы. P. Bohanec Grabar и соавт. обнаружили снижение риска общей токсичности метотрексата у гомозиготных носителей аллеля A [24, 25]. Однако A. Lima и соавт. зафиксировали увеличение частоты осложнений со стороны желудочно-кишечного тракта [26]. Результаты других исследований не продемонстрировали подобной ассоциации [27, 28].

Полиморфизм rs2838956 может рассматриваться как фактор повышенного риска развития нежелательных реакций со стороны кожи. Так, P. Bohanec Grabar и соавт. выявили тенденцию к поражению кожи у носителей аллеля A [25]. Влияние полиморфизма rs2838956 на эффективность терапии метотрексатом не до конца изучено. Известно, что мутация происходит в интроне 5 и характеризуется заменой аденина на гуанин в позиции 707 [25]. Кроме того, получены данные о хорошей эффективности метотрексата у пациентов с полиморфизмом rs2838956 [27].

ABCB1

Белок множественной лекарственной резистентности 1 (MDR1), или P-гликопротеин 1, кодируется геном ABCD1 [29]. Он представляет собой энергозависимый однонаправленный транспортер. MDR1 локализуется на апикальной мембране многих эпителиальных, эндотелиальных клеток и лимфоцитов. Играет ключевую роль в абсорбции и распределении метотрексата в организме [28]. Одним из самых значимых однонуклеотидных полиморфизмов гена ABCB1 считается замена цитозина на тимин в 3435-м положении (rs1045642/C3435T) [30]. Полагают, что он может быть связан как с тяжестью токсичности, так и с эффективностью метотрексата при терапии ревматоидного артрита. M.C. de Rotte и соавт. отметили повышение эффективности метотрексата у носителей этой мутации. По мнению ученых, это обусловлено нарушением выведения метотрексата [31]. В то же время известно, что MDR1, локализованный на клеточной мембране CD4- и CD8-лимфоцитов, NK-клеток и их предшественников, регулирует транспорт ряда медиаторов воспаления, в частности биоактивных липидов. Связанное с мутацией C345T снижение активности MDR1 может сократить транспорт медиаторов воспаления и, как следствие, способствовать развитию хорошего терапевтического эффекта метотрексата [32]. В ряде фармакогенетических исследований продемонстрировано увеличение токсичности у T-гомозиготных пациентов [24]. J.C. Plaza-Plaza и соавт. отметили тенденцию к развитию нежелательных реакций у носителей аллеля C [33].

ABCC1

Геном ABCC1 кодируется белок, связанный с множественной лекарственной устойчивостью 1 (MRP1). Этот трансмембранный протеин присутствует во всех отделах кишечника и формирует 17 трансмембранных регионов [29]. Существует несколько вариантов полиморфизма гена ABCC1: rs35592, rs2074087, rs2230671. Каждый из них характеризуется замещением одного нуклеотида другим в определенном участке гена.

Значение первых двух мутаций в отношении эффективности и безопасности терапии метотрексатом до конца не выяснено, поэтому требуется проведение дополнительных исследований.

Влияние полиморфизма rs2230671 также окончательно не подтверждено. Однако G-гомозиготы имеют повышенный уровень мРНК в клетках, что может быть причиной увеличения дозы метотрексата [34]. Связь между токсическим эффектом метотрексата и геном ABCC1 не обнаружена [35].

ABCC2

Ген ABCC2 кодирует синтез белка, связанного с множественной лекарственной устойчивостью 2 (MRP2). Он также известен как канальцевый мультиспецифический транспортер органических анионов [36]. В первую очередь продукт гена ABCC2 представлен на апикальной мембране гепатоцитов, а также в эпителиальных клетках тонкого кишечника и почек [37]. MRP2 является анионным конъюгатом и играет важную роль в транспорте как эндогенных, так и экзогенных соединений. Кроме того, с помощью этого белка осуществляется перенос некоторых лекарственных средств. В частности, для метотрексата и 7-гидроксиметотрексата MRP2 является основным путем элиминации из клетки, поэтому опосредованное мутациями гена ABCC2 изменение его активности имеет важное значение для развития нежелательных реакций. Так, замена G на A в 1249-м регионе (rs2273697) может приводить к увеличению токсического эффекта метотрексата. Согласно данным P. Ranganathan и соавт. [35], A-гомозиготы характеризовались повышенным риском поражения желудочно-кишечного тракта при приеме метотрексата. Ученые выявили связь между высокой частотой поражения гепатобилиарного тракта и полиморфизмом G1058A (rs7080681). Кроме того, указано на высокую частоту осложнений со стороны печени у A-гомозигот.

ABCG2

Еще одним геном, который влияет на перенос метотрексата через мембрану клетки, является ABCG2. Последний участвует в синтезе представителя G-класса – белка, связанного с резистентностью рака молочной железы (BCRP) [38]. Экспрессия BCRP отмечена во многих тканях человеческого организма, включая клетки печени и почек [28, 37]. Наряду с развитием резистентности тканей опухоли к ряду препаратов в нормальных тканях BCRP ассоциируется с утилизацией некоторых субстратов, что предотвращает их накопление и токсическое влияние на организм [39]. Данный белок также участвует в формировании гистогематических барьеров, например гематоэнцефалического, гематоплацентарного и гематотестикулярного. В отсутствие гена АВСG2 элиминация метотрексата и 7-гидроксиметотрексата, а также полиглутаминированной формы метотрексата осуществляется BCRP [40]. Повышенная экспрессия BCRP отмечена на мембране макрофагов, представленных в синовиальной ткани у больных ревматоидным артритом. Кроме того, гиперэкспрессия гена ABCG2 связана с сохранением макрофагов в синовиальной ткани по окончании терапии метотрексатом [41]. Замене G на A в позиции 421 (С421A, rs2231142) соответствует замещение лизина на глутамин в положении 141 [42]. Подобное изменение структуры транспортера приводит к снижению его активности и ограничению возможности элиминации метотрексата из клетки [43], результатом чего является высокий риск общей токсичности от приема препарата [44].

Фармакогенетика ферментов пути метаболизма метионина и фолата

DHFR

Дигидрофолатредуктаза (DHFR) – один из ключевых ферментов метаболизма фолатов – является мишенью метотрексата. Ген DHFR локализуется на хромосоме 5q11 [45]. Наиболее часто встречающимися полиморфизмами гена DHFR считаются G473A (rs1650697) в 5'-нетранслируемой области и A35289G (rs1232027), расположенный вблизи от места инициации трансляции [46]. Необходимо отметить, что данные, указывающие на их связь с эффективностью или токсичностью метотрексата, отсутствуют. Однако при исследовании других полиморфизмов (rs12517451, rs10072026, rs1643657) обнаружено увеличение частоты развития побочных явлений у получавших метотрексат [27]. Кроме того, у пациентов с AA-генотипом полиморфизма A317G (rs408626) наблюдался менее благоприятный ответ на терапию [47].

MTHFD1

Метилентетрагидрофолатдегидрогеназа (MTHFD1) – фермент, кодируемый геном MTHFD и расположенный на хромосоме 14q24 [45]. Основным полиморфизмом гена MTHFD считается замена G на A в позиции 1958. В результате этой мутации вместо аргинина кодируется молекула глицина. В настоящее время точное значение этого полиморфизма не исследовано [28]. Тем не менее получены данные, указывающие на связь G1958A с развитием токсичности [48]. В других исследованиях такая связь отрицается [28].

MTHFR

Метилтетрагидрофолатредуктаза (MTHFR) выступает в качестве основного фермента, регулирующего метаболизм как фолата, так и метионина [49]. Ген MTHFR расположен на хромосоме 1p36. Изменение его активности имеет предопределяющее значение для результата терапии. В настоящее время среди множества известных полиморфизомов гена MTHFR наиболее изученными и актуальными остаются C677T (rs1801133) и A1298C (rs1801131) [45]. Несмотря на активное изучение этих мутаций, получены противоречивые результаты. Так, неоднократно продемонстрировано, что у T-гомозигот полиморфизма C677T высок риск возникновения нежелательных реакций на фоне терапии метотрексатом [33, 35, 50]. В других работах корреляция между полиморфизмом C677A и токсичностью не установлена [24, 46, 51]. Аналогичная ситуация складывается в отношении полиморфизма A1298A. В 2012 г. исследователи выявили, что у носителей генотипа CC частота развития нежелательных реакций была выше, чем у носителей генотипа AA [52]. Кроме того, у пациентов с полиморфизмом C677A отмечена высокая вероятность увеличения активности аминотрансфераз [51]. При проведении метаанализа установлена статистически значимая ассоциация общей токсичности при приеме метотрексата с наличием аллеля C, благоприятная роль генотипа CC у гомозиготных больных ревматоидным артритом [53].

Указывается также на ассоциированную с полиморфизмом эффективность терапии. Согласно данным H. Xiao и соавт., пациенты с генотипами CC и AC лучше отвечали на терапию метотрексатом [50]. Кроме того, в исследовании T. Kato и соавт. у носителей генотипа AA после проведенной терапии активность болезни по DAS 28 была значительно ниже, чем у больных с другими генотипами [22].

MTR

В присутствии витамина B₁₂ синтез тетрагидрофолата происходит одновременно с формированием метионина при помощи метилтрансферазы (MTR) [49]. Ген MTR локализуется на хромосоме 1q43. Основным его полиморфизмом является замещение A на G в позиции 2756. На месте аспарагина в кодоне 919 синтезируется молекула глицина, что влияет на активность фермента [54]. В исследовании Y. Becrun и соавт. у гомозиготных пациентов с генотипом GG отмечена высокая частота развития нежелательных реакций [55]. В то же время J.A. Wessels и соавт. такую связь не выявили [56].

Заключение

Несмотря на появление целого ряда лекарственных средств, метотрексат остается препаратом выбора у больных ревматического профиля в силу высокой эффективности. Иммуномодулирующее и противовоспалительное действие препарата основано на индукции апоптоза быстропролиферирующих клеток (активированных Т-лимфоцитов, фибробластов, синовиоцитов), ингибировании синтеза противовоспалительных цитокинов (интерлейкин 1, фактор некроза опухоли альфа), усилении синтеза противовоспалительных цитокинов (интерлейкинов 4 и 10), подавлении активности металлопротеиназ.

В настоящее время интерес к изучению новых механизмов действия метотрексата сохраняется. Например, подавление пролиферации мононуклеарных клеток и синтеза антител (ревматоидного фактора) В-лимфоцитами, синтеза интерлейкина 1, пролиферации эндотелиальных клеток и фибробластов, функциональной активности нейтрофилов, активности протеолитических ферментов в полости сустава, усиление синтеза антагонистов растворимых рецепторов интерлейкина 1 и растворимых рецепторов фактора некроза опухоли альфа. Актуальным является изучение участия метотрексата в подавлении Syk-зависимой активации В-клеток за счет уменьшения синтеза провоспалительных цитокинов (в частности, интерлейкина 2). Определение роли метотрексата в блокировании сигнализации JAK-STAT, без влияния на другие сигнальные пути, связанные с фосфорилированием белков. Сохранение способности клеток реагировать на физиологическую стимуляцию JAK-2 эритропоэтином на фоне терапии метотрексатом [7].

Анализ данных реальной клинической практики, изучение факторов, определяющих эффективность, резистентность и токсичность терапии метотрексатом в зависимости от его дозы, формы введения (перорально или подкожно), также остается актуальным. В частности, улучшить прогноз в отношении возникновения нежелательных реакций на фоне приема метотрексата, решить вопрос о персонализации его назначения позволят результаты исследований, проводимых в области фармакогенетики. Фармакогенетика позволяет установить связь между генотипом пациента и ожидаемой эффективностью проводимой терапии, что может способствовать выбору адекватной дозы метотрексата. На данный момент времени полученные результаты противоречивы, поэтому требуется проведение большего числа исследований с участием больших групп пациентов.  

Настоящая публикация подготовлена в рамках научно-исследовательской работы по теме «Разработка методов персонифицированной терапии ревматических заболеваний с коморбидной патологией»

(АААА-А19-119021190151-3, 0514-2019-0020).