Многопараметрический анализ биомаркеров для оценки эффективности инфликсимаба при ревматоидном артрите

Таблица 1. Динамика концентраций биомаркеров у больных ревматоидным артритом на фоне терапии ИНФ

Таблица 2. Коэффициенты прогностической модели эффективности применения ИНФ при ревматоидном артрите

Введение

Ревматоидный артрит (РА) – аутоиммунное ревматическое заболевание неизвестной этиологии, характеризующееся хроническим эрозивным артритом (синовитом) и системным поражением внутренних органов [1].

В основе патогенеза РА лежит генетически детерминированная и индуцированная факторами внешней среды (курение, инфекции и др.) персистирующая активация приобретенного и врожденного иммунитета в ответ на разнообразные патогены, что ведет к потере иммунологической толерантности к собственным антигенам [2, 3]. Особенностями иммунопатологического процесса при РА являются дефект В-клеточной толерантности, сопровождающийся продукцией аутоантител, и антиген-специфическая активация CD4⁺-T-лимфоцитов по Th1-типу с преобладанием синтеза провоспалительных (фактора некроза опухоли α (TNF-α), интерлейкинов (IL) 12, 1β, 6, 7, 15, 17, 18, интерферона γ (IFN-γ)) над синтезом противовоспалительных цитокинов (IL-4, -5, -10, -13, трансформирующего фактора роста β (TGF-β)) [4, 5].

Разработка и быстрое внедрение в клиническую практику генно-инженерных биологических препаратов (ГИБП), включая моноклональные антитела против провоспалительных цитокинов, представителями которых являются химерные моноклональные антитела к TNF-α – инфликсимаб (ИНФ), обусловливают необходимость совершенствования иммунологических методов определения предикторов эффективного ответа на проводимую терапию [5, 6].

Данные об использовании иммунологических маркеров для прогнозирования ответа на терапию ГИБП у пациентов с РА противоречивы. Последние годы для поиска таких биомаркеров все шире применяется основанный на протеомных технологиях мультиплексный анализ [7].

Целью данного исследования стала оценка результатов многопараметрического анализа лабораторных биомаркеров для прогнозирования эффективности терапии ИНФ при РА.

Материал и методы

Обследовано 27 пациентов с подтвержденным диагнозом РА (согласно классификации Американской коллегии ревматологов 1987 г.), из них 25 женщин. Средний возраст больных – 46,5 (41,5–61,5) года. Длительность заболевания – семь (4–11) месяцев. Патологический процесс по шкале активности заболевания (DAS 28) – шесть (пять-шесть) баллов.

ИНФ вводили внутривенно капельно из расчета 3 мг/кг массы тела, первые две инфузии – с интервалом две недели, следующую – через шесть недель, далее – каждые восемь недель.

Терапевтический эффект ГИБП оценивали по критериям Европейской антиревматической лиги [8].

Концентрацию иммуноглобулина M (IgM) ревматоидного фактора (РФ) и С-реактивного белка (СРБ) в сыворотке крови измеряли иммунонефелометрическим методом на анализаторе BN-ProSpec (Германия), антител к циклическому цитруллинированному пептиду (АЦЦП) – методом иммуноферментного анализа с использованием коммерческого набора реагентов Axis-Shield Anti-CCP (Великобритания). Количественное определение цитокинов в сыворотке крови проводилось методом мультиплексного анализа по технологии xMAP на анализаторе Bio-Rad Bio-Plex 200 (США). Речь, в частности, идет о таких цитокинах, как IL-1β, -1ra, -2, -4, -6, -10, -12, -13, -15, -17, фактор роста фибробластов (FGF), эотаксин, гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), IFN-γ, индуцибельный белок 10 (IP-10), макрофагальный белок воспаления 1 (MCP-1), макрофагальный белок воспаления 1α (MIP-1α), TNF-α. Статистический анализ результатов проводили с помощью программного комплекса EpiInfo 7.0, рекомендованного для использования в медико-биологических приложениях. Для обработки результатов использовали общепринятые методы параметрического и непараметрического анализа. Результаты представлены в виде медианы (Ме) с интерквартильным размахом (25-й и 75-й перцентили). Корреляционный анализ проводился по методу Спирмена. Различия считались достоверными при p < 0,05. Прогноз значений одной переменной по другим проводили с помощью многофакторного анализа. Показатель h₁...h_n рассчитывали по формуле:

Для сравнительного анализа вклада факторов в прогностическую модель применяли нестандартизованный и стандартизованный коэффициенты (b_k и β_k). Последний рассчитывали по формуле:

Кроме того, оценивали p.

Клиническую значимость полученной прогностической модели определяли с помощью построения ROC-кривой.

Результаты

Через шесть недель терапии ИНФ у пациентов снизились уровни IgM РФ, АЦЦП, IL-1rа, -7, -10, -12, FGF-2, MIP-1α, через 14 недель – скорость оседания эритроцитов (СОЭ), уровни IgM РФ, IL-1β, -1rа, -2, -4, -6, -10, -12, -13, -15, -17, эотаксина, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MIP-1α, TNF-α, через 24 недели – СОЭ, уровни СРБ, IgM РФ, основных провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-6, -12, -15 и противовоспалительных цитокинов IL-1ra, -10, а также Th1-цитокинов IL-2, IFN-γ, GM-CSF и хемокинов IP-10, MCP-1 (табл. 1).

На 24-й неделе у 14% пациентов, положительных в отношении IgM РФ, и 4,5% – в отношении АЦЦП зафиксирована сероконверсия в отрицательный результат. У 8% больных, отрицательных в отношении IgM РФ, и 33% пациентов, отрицательных в отношении АЦЦП, – в положительный результат.

С целью выбора оптимальной панели биомаркеров проведен пошаговый линейный регрессионный анализ их базальных концентраций. В качестве возможных предикторов клинического ответа тестировали:

• аутоантитела IgM РФ и АЦЦП;
• лабораторные маркеры воспаления СОЭ и СРБ;
• цитокины IL-1β, -1ra, -2, -4, -5, -6, -7, -8, -9, -10, -12, -13, -15, -17, FGF-2, эотаксин, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, IP-10, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β, фактор роста тромбоцитов ВВ (PDGF-ВВ), RANTES, TNF-α, фактор роста эндотелия сосудов (VEGF).

Исходя из полученных данных, наиболее значимыми для прогнозирования эффективности ИНФ являются IL-12 (площадь под характеристической кривой 0,85), IL-17 (0,8), IL-9 (0,8) и СРБ (0,8) (табл. 2).

Вероятность эффективности рассчитывали по формуле: 1,6 - 0,013 × [IL-12] - 0,026 × [IL-17] - 0,18 × [IL-9] - 0,02 × [СРБ]. Полученную величину выражали в условных единицах. При < 0,45 применение данного ГИБП считалось неэффективным, от 0,45 до 0,74 вероятность клинического ответа составляла 67%, > 0,74 – 100%. При проверке точности прогноза с помощью построения ROC-кривой площадь под ней составила 0,96 (доверительный интервал 0,0–0,1).

Обсуждение

В большинстве исследований на фоне применения ингибиторов TNF-α в сыворотках больных РА отмечалось значительное (30–60%) снижение концентрации IgМ РФ [8–12]. Эти данные сопоставимы с результатами нашего исследования. Кроме того, на фоне терапии ИНФ нами выявлена отрицательная (14%) и положительная (8%) IgM РФ-сероконверсия. В отличие от IgМ РФ сывороточный уровень АЦЦП под воздействием ингибиторов TNF-α, как правило, не меняется [9–11, 13–19]. Существенное снижение данного показателя описано в единичных случаях, например при терапии адалимумабом. Отрицательная АЦЦП-сероконверсия также обнаруживается у незначительной части пациентов (4,5%) [20]. По нашим данным, к 24-й неделе терапии ИНФ уровень АЦЦП не изменялся, при этом у 4,5% пациентов отмечена отрицательная, а у 33% – положительная сероконверсия.

Практически все ингибиторы TNF-α индуцируют быстрое (в течение месяца) снижение уровня маркеров острой фазы воспаления: СОЭ и СРБ [21–25]. Нами установлено, что СОЭ достоверно снижалась через три с половиной месяца применения ИНФ, уровень СРБ – через шесть.

I. Sekigawa и соавт. впервые с помощью масс-спектрометрии изучили влияние ИНФ на белково-пептидный профиль сыворотки/плазмы крови у десяти больных РА [26]. Установлено, что уже через 24 часа после введения препарата возможно идентифицировать белки, участвующие в TNF-α-зависимых механизмах активации NF-kB (FAM62A/MBC2) и регенерации суставного хряща (CTGF). Аналогичные результаты получены R.C. Dwivedi и соавт. [27]. Через 12 недель от начала терапии у трех пациентов с хорошим ответом на препарат отмечено 20%-ное изменение концентрации 39 белков, регулируемых TNF-α или NF-kB. В целом на фоне ингибиторов TNF-α наблюдались снижение уровней IL-6, VEGF, сывороточного уровня хрящевого гликопротеина 39 (YKL-40, HC gp-39) и миграция ингибирующего фактора (MIF) [28, 29].

Согласно полученным нами данным, на 24-й неделе терапии ИНФ происходит снижение основных провоспалительных цитокинов TNF-α, IL-6, -12, -15, цитокинов, обладающих противовоспалительной функцией, IL-1ra, -10, Th1-цитокинов IL-2, IFN-γ, GM-CSF и хемокинов IP-10, MCP-1. 

На большом клиническом материале показано, что до начала лечения положительные результаты в отношении IgM РФ и АЦЦП ассоциируются с неудовлетворительным клиническим ответом на ингибиторы TNF-α [30–32]. G. Wolbink и соавт. установили, что высокий исходный уровень СРБ у больных РА коррелирует с более низким ответом на ИНФ через 14 недель применения [33].

При многоступенчатом исследовании сывороточных белков идентифицирован профиль аутоантител и цитокинов, позволяющих прогнозировать ответ на терапию этанерцептом у больных РА [28]. Согласно нашим результатам, наиболее значимыми с точки зрения клинического ответа на ИНФ являются базальные уровни IL-12, -17, -9 и СРБ, Th17- и Th2-цитокинов, а также белка острой фазы воспаления, что в целом согласуется с результатами более ранних исследований. Эти данные сделали возможным создание многопараметрического диагностического индекса для прогнозирования ответа на ИНФ.

Заключение

Многопараметрический анализ базальных уровней лабораторных биомаркеров может стать новым этапом в прогнозировании эффективности терапии ингибиторами TNF-α при РА.