Характеристика и выявление диссеминированных опухолевых клеток в костном мозге у пациентов c меланомой кожи методом проточной цитометрии

Таблица 1. Распределение больных по стадиям заболевания

Таблица 2. Моноклональные антитела, использованные в работе

Рис. 1. Диссеминированные опухолевые клетки меланомы кожи в костном мозге (А – десятикратное увеличение, Б – стократное увеличение)

Таблица 3. Частота выявления ДОК при различных стадиях меланомы

Рис. 2. Диссеминированные опухолевые клетки меланомы кожи в костном мозге

Рис. 3. Выявление CD133-позитивных ДОК при меланоме

Введение

Несмотря на имеющиеся знания базовой биологии рака и достижения в диагностике и лечении, которые значительно улучшили показатели безрецидивной выживаемости, уровень смертности от злокачественных новообразований за последние 40 лет существенно не изменился [1]. Возможно, это связано с тем, что предметом исследований были в основном первичные опухоли, а не метастазирование – главная причина смерти онкологических больных.

Сегодня доказано, что рак – болезнь, изначально имеющая системный характер. Следовательно, способность к метастазированию возникает на самых ранних этапах канцерогенеза [2].

Процесс гематогенного метастазирования в упрощенном виде включает инвазию, то есть выход опухолевых клеток за пределы первичной опухоли, интравазацию в кровеносные сосуды, выживание в циркуляции, остановку в определенных тканях, экстравазацию за пределы сосуда, состояние покоя и своего рода метастатическое пробуждение [3].

С биологической точки зрения метастазирование – процесс крайне неэффективный. Каждый шаг каскада является уязвимым местом для опухолевых клеток и сопровождается их клональным отбором. К концу процесса только небольшая часть из сотни тысяч клеток, ежедневно покидающих первичную опухоль, достигает анатомически отдаленных мест и способна к колонизации [4]. Диссеминированные опухолевые клетки (ДОК) являются единственным признаком болезни и считаются предвестниками метастазирования, оставаясь в течение длительного периода времени бессимптомными [5]. Но даже наличие единичных ДОК в организме таит в себе большую угрозу, поскольку, сохранив пролиферативный потенциал, они могут реализоваться в клинические метастазы спустя годы, а иногда и десятилетия после латентного периода «спячки» [2, 6].

Миелоидный костный мозг (КМ) – основной орган-мишень для колонизации ДОК. КМ имеет хорошее кровоснабжение, а также развитую сеть мелких фенестрированных кровеносных сосудов-синусоидов. Это создает повышенную проницаемость и более легкий физический барьер для экстравазации опухолевых клеток в КМ в отличие от других органов [7]. В то же время уникальные характеристики костномозговой ниши обеспечивают сигналы самонаведения, а биохимические (цитокины, хемокины, факторы роста и др.) и физические (кислотный pH, высокая концентрация внеклеточного кальция и др.) факторы создают тонко организованное микроокружение, которое является наиболее притягательным местом для опухолевых клеток [8]. Будучи изначально чужеродным, КМ подстраивает свою среду за счет  сложных антигенных, иммуногенных и клеточных механизмов, формируя благоприятные условия для персистенции ДОК [9, 10].

Диагностика гематогенного распространения злокачественных новообразований на ранних стадиях – одна из главных проблем современной онкологии. Выявить ДОК с помощью рутинных патоморфологических методов крайне сложно. Диагностика ДОК требует применения высокочувствительных иммунологических методов.

В течение последнего десятилетия были созданы различные платформы для обнаружения ДОК в КМ. Одним из наиболее функциональных и информативных методов обнаружения ДОК признан метод проточной цитометрии, обладающий высокой чувствительностью и позволяющий всесторонне оценивать различные популяции клеток КМ (причем не в среднем, а каждую клетку отдельно) на основании мультипараметрического анализа поверхностных маркеров [11].

Информативность исследования КМ при различных опухолях негемопоэтической природы доказана неоднократно. В многочисленных клинических исследованиях выявлена достоверная корреляция между наличием ДОК в КМ и ухудшением выживаемости больных при раке молочной железы [12], предстательной железы [13], легкого [14], толстой кишки [15], а также при злокачественных новообразованиях других локализаций. В свою очередь проблема микрометастазирования в КМ при меланоме требует дальнейшего анализа.

Как и другие солидные опухоли, меланома способна к гематогенной диссеминации уже на ранних стадиях развития [16]. Случаи возникновения висцеральных метастазов при меланоме спустя десять [17] и даже 40 лет [18] после удаления первичной опухоли без вовлечения регионарных зон, а также частое манифестирование меланомы без выявленного первичного очага позволяют говорить о склонности меланомных клеток к распространению из индолентных очагов [19], таких как КМ.

Одним из наиболее надежных маркеров идентификации клеток меланомы является НМВ-45 (цитоплазматический премелацитарный гликопротеин gp100). Он классифицируется как антиген дифференцировки меланоцитов и отсутствует в опухолях немеланоцитарного происхождения. Обладая высокой чувствительностью (до 93%) и специфичностью (до 100%), HMB-45 служит надежным маркером идентификации клеток меланомы, что позволяет использовать его для идентификации ДОК [20].

Цель исследования – оценить возможность выявления ДОК меланомы в КМ на основании экспрессии HMB-45 методом проточной цитометрии, частоту поражения КМ у больных меланомой и определить субпопуляционный состав ДОК при меланоме в отношении экспрессии CD56, CD57, являющихся дополнительным критерием при иммуногистохимической диагностике меланомы, а также количество стволовых опухолевых клеток среди ДОК по наличию антигена CD133.

Материал и методы

В исследование было включено 47 больных (23 мужчины и 24 женщины) в возрасте от 20 до 72 лет (медиана – 49,8 года), находившихся под наблюдением по поводу меланомы кожи в Национальном медицинском исследовательском центре (НМИЦ) онкологии им. Н.Н. Блохина в 2018–2019 гг. У всех пациентов диагноз подтвержден гистологически. В 42,6% случаев, согласно результатам комплексного обследования, установлена IV стадия заболевания. Распределение больных по стадиям представлено в табл. 1.

Образцы КМ получены при пункции гребня подвздошной кости до начала лечения, в отдельных случаях использованы одномоментные пункции грудины и гребня подвздошной кости. Оценка поражения костного мозга проведена в лаборатории иммунологии гемопоэза НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина морфологическим и иммунологическим методами.

Морфологическое исследование включало подсчет миелограммы и поиск микрометастазов и выполнялось двумя морфологами параллельно на шести стеклах, окрашенных методом Романовского.

Впервые в России проведена иммунологическая оценка наличия ДОК в КМ при меланоме кожи с использованием проточной цитометрии, что позволило увеличить пороговое значение до 1 × 10-7 миелокариоцитов. С этой целью мы использовали высокоскоростной цитометр FACS Canto II (США) с революционирующей технологией фокусов клеток для многопараметрического анализа клеточной суспензии [21]. Оценивалось 20 млн миелокариоцитов (или все клетки образца), окрашенных методом прямой иммунофлюоресценции с использованием зарубежных моноклональных антител (МКА), меченных флюорохромами (табл. 2).

Результаты анализировали с помощью программы Kaluza Analysis v2.1 (Beckman Coulter, США). Статистический анализ выполнен с использованием статистического пакета IBM-SPSS Statistics v.17.

Результаты

Морфологический анализ пунктатов КМ включал подсчет миелограммы и поиск микрометастазов. Морфологически ДОК выявлены только в одном из 47 случаев. На рисунке 1 представлен случай выявления клеток меланомы кожи в пунктате КМ. Как видно, пунктат КМ беден. Нормальные ростки миелопоэза угнетены. При просмотре препаратов определены комплексы клеток негемопоэтической природы, а также разрозненные, отдельно лежащие опухолевые клетки крупного размера. В цитоплазме обнаружены базофильно-окрашенные гранулы пигмента различного размера. Морфологическая картина КМ характерна для метастатического поражения при меланоме.

При иммунологической оценке наличия ДОК в КМ за пороговый уровень принималась одна опухолевая клетка (Syto41+CD45-HMB-45+) на 10 млн миелокариоцитов. Среднее значение проанализированных в каждом образце клеток составило 14 146 987 миелокариоцитов (± 957 728 клеток). С учетом заданного порогового значения ДОК выявлены в 57,4% образцов КМ (n = 27). Статистически достоверных различий по количеству ДОК в зависимости от пола, возраста и стадии заболевания не получено. Важно, что поражение КМ наблюдалось на всех стадиях заболевания (табл. 3). Даже при клинически локализованном процессе отмечалась гематогенная диссеминация опухоли.

Дополнительно ДОК характеризовали с точки зрения экспрессии CD56 и CD57. Указанные молекулы служат дополнительными критериями при иммуногистохимической диагностике вариантов меланомы. В данном исследовании экспрессия CD56 и CD57 оценивалась в 23 образцах КМ. ДОК в данной группе выявлены в 54,2% случаев (n = 13), однако экспрессии CD56 на этих клетках не обнаружено. Экспрессия CD57 на ДОК зарегистрирована в шести (46,2%) случаях (рис. 2). Важно, что не все ДОК в каждом образце КМ характеризовались экспрессией CD57. В среднем 87,4 ± 5,8% ДОК были CD57-позитивны. Интересно, что 50% больных с CD57+ имели IV стадию заболевания, двое из шести пациентов – III стадию, один – стадию IIС. На рисунке 2 показано выявление диссеминированных опухолевых клеток при меланоме кожи. Клетки характеризуются отчетливой экспрессией CD57 (ось Y) и отсутствием экспрессии CD45 (ось X). Большинство ДОК (91,19%) CD57-положительны.

Особая роль в процессах метастазирования отводится минорной популяции стволовых опухолевых клеток (СОК), обладающих наибольшей устойчивостью к традиционным методам противоопухолевой терапии. По данным литературы, СОК меланомы характеризуются экспрессией антигенов, таких как CD44, CD271, CD133. Нами предпринята попытка оценить экспрессию маркеров СОК на примере CD133.

Экспрессию CD133 оценивали в 22 образцах КМ. Половина образцов КМ этой группы характеризовалась ДОК-позитивностью. Только в одном ДОК-позитивном пунктате выявлена популяция CD133-положительных ДОК, их количество составило 1,38% всех ДОК в данном случае (рис. 3).

Следует отметить, что из-за относительно небольшой частоты обнаружения клеток меланомы в КМ требуются дальнейший набор материала и расширение панели антигенов для подробной иммунологической характеристики СОК и определения их значения в прогнозе больного.

Заключение

Меланома уникальна тем, что обычно хорошо видна на поверхности тела. Несмотря на то что визуальная локализация делает ее легко доступной для диагностики, а небольшой размер предполагает кажущийся благоприятный прогноз, меланома – одно из самых коварных злокачественных новообразований с крайне высоким метастатическим потенциалом. Некоторые первичные меланомы способны гематогенно диссеминировать и приводить к летальному исходу, даже когда объем опухоли находится в пределах кубического миллиметра. Поскольку распространение опухолевых клеток считается ключевым событием в развитии опухоли, поиск новых современных прогностических факторов, позволяющих определить прогноз меланомы, и маркеров, свидетельствующих о ранней диссеминации опухолевого процесса, остается крайне актуальным при данном заболевании. Изучение ДОК позволит восполнить этот пробел.

Результаты нашего исследования демонстрируют, что метод проточной цитометрии с использованием специфического антитела HMB-45 в комбинации с CD45 может рассматриваться в качестве новой методики для выявления распространения ДОК в КМ у пациентов с меланомой. ДОК выявлены в 57,4% случаев меланомы кожи. При этом даже у больных c I стадией заболевания ДОК имели место в 28,6% случаев, что подтверждает агрессивное течение меланомы кожи даже при локализованном процессе. Наличие экспрессии CD57 и CD133 свидетельствует о гетерогенности меланомной популяции ДОК и сложных иерархических взаимосвязях между первичной опухолью и ДОК. Прогностическое значение полученных данных еще предстоит оценить.

Несмотря на то что кости не являются частым местом метастазирования, наличие ДОК в КМ может расцениваться как доказательство общей способности меланомы к диссеминации. Предположительно ДОК могут присутствовать и в других органах, например печени и легком. В то же время КМ служит основным резервуаром опухолевых клеток, из которого они рециркулируют в различные органы, как было недавно продемонстрировано на экспериментальных моделях меланомы [22]. В обоих случаях свидетельство о ДОК-положительном статусе КМ указывает на высокую злокачественность и дает возможность выявить группу пациентов с высоким риском прогрессирования, которые могут получить пользу от дополнительной терапии [23]. Исследование дополнительных фенотипических маркеров на ДОК позволит увеличить прогностическую силу этого подхода и точно определить конкретные терапевтические цели, подходящие для устранения единичных опухолевых клеток.