Некоторые аспекты противоопухолевого иммунитета при раке молочной железы

Рис. 1. Распределение степени инфильтрации TILs

Удельный вес CD3/CD4/CD8+-лимфоцитов в зависимости от размера опухоли (pT)

Рис. 2. Распределение CD3+/CD4+/CD8+-лимфоцитов на единицу площади опухоли

Рис. 3. ИГХ-окрашивание PD-L1: А – нет окрашивания, Б – окрашивание лимфоцитов, нет окрашивания в эпителиальных клетках опухоли, В – окрашивание эпителиальных клеток опухоли, Г – окрашивание в обоих компонентах опухоли

Рис. 4. Взаимосвязь между уровнем экспрессии PD-L1 и размером опухоли (рТ)

Рис. 5. Положительный тест PD-L1 при различных подтипах РМЖ

Рис. 6. Зависимость удельного веса CD3+, CD4+, CD8+-лимфоцитов от уровня экспрессии PD-L1

Рис. 7. Выживаемость в зависимости от уровня CD4+. Оценка уровня CD4+-Т-лимфоцитов. Визуальный полуколичественный метод. Автоматизированная обработка цифровых изображений < 20%; > 20%

Рис. 8. Безрецидивная выживаемость в зависимости от уровня CD3+-лимфоцитов в строме опухоли (группа 1 – 0–5%, группа 2 – 5–20%, группа 3 > 20%)

Рис. 9. Десятилетняя безрецидивная (А) и общая выживаемость (Б) в зависимости от экспрессии PD-L1 на эпителиальных опухолевых клетках (группа 0 – нет экспрессии, группа 1 – экспрессия в клетках опухоли и внутриопухолевых лимфоцитах)

Рис. 10. Кривые безрецидивной выживаемости (Каплана – Майера) в зависимости от экспрессии FOXP3 на внутриопухолевых лимфоцитах (группа 0 – экспрессия в любом количестве клеток, группа 1 – нет экспрессии)

Рис. 11. ИГХ-исследование экспрессии гена FOXP3

Рис. 12. Уровни экспрессии FOXP3 при различных размерах опухоли (pТ)

Рис. 13. Взаимосвязь между уровнем экспрессии FOXP3 и удельным весом CD3+, CD4+, CD8+

Рис. 14. Зависимость показателя общей выживаемости от экспрессии FOXP3+/СD8+ на внутриопухолевых лимфоцитах (группа 1 – ко-экспрессия не выявлена, группа 0 – ко-экспрессия выявлена в любом количестве; p = 0,048)

Введение

На примере различных типов солидных опухолей показано значение лимфоцитарной инфильтрации в прогнозировании прогрессирования заболевания [1–3]. Она особенно заметна при раке толстой и прямой кишки, а также раке яичников, когда присутствие опухоль-инфильтрирующих Т-клеток связано с уменьшением частоты рецидивов и более продолжительной выживаемостью. Кроме того, модуляция Т-клеточного ответа продемонстрировала клиническую эффективность у пациентов с солидными опухолями, а туморицидный эффект трастузумаба напрямую зависел от иммунного ответа при раке молочной железы (РМЖ).

Некоторые аспекты иммунобиологии РМЖ, в частности роль лимфоцитарной инфильтрации опухоли, начали изучать в Научно-исследовательском институте (НИИ) онкологии им. Н.Н. Петрова в 1967 г. Результаты этого исследования были опубликованы в 1970 г. [1, 2].

Будучи важным элементом адаптивной иммунной системы, цитотоксические Т-клетки (CD8+) могут стать потенциальным биомаркером иммунного ответа на опухоль. В большинстве ранних исследований Т-клеток CD8+ у больных РМЖ сообщалось о связи с благоприятным исходом. Однако в других исследованиях это не подтвердилось. В отличие от Т-лимфоцитов Т-регуляторные лимфоциты (Treg) оказывают иммуносупрессивный эффект, уменьшая ответ на аутоантигены. В связи с этим в ходе научно-исследовательской работы предстояло решить следующие задачи:

• в условиях неоадъювантной системной терапии оценить уровни иммунного ответа опухоли у пациентов с РМЖ (стадии IIA, IIB, IIIA) по данным трепанбиопсии и исследования операционного препарата;
• изучить прогностическое значение Т-клеточной (CD8+, CD3+) лимфоцитарной инфильтрации опухоли и уровня Т-регуляторных (CD4+) лимфоцитов (Treg);
• с помощью иммуногистохимического (ИГХ) исследования проанализировать прогностическое и предиктивное значение экспрессии белков Forkhead Box Protein 3 (FOXP3), ингибиторов контрольных точек PD-1, PD-L1.

Материал и методы

Кроме клинической стадии РМЖ основным требованием при определении прогностических групп РМЖ для стратификации больных групп высокого и низкого риска, исходя из последних представлений (AJCC-8 (American Joint Committee on Cancer), 8-я классификация Американского объединенного онкологического комитета), является установление степени гистологической злокачественности и рецепторного статуса опухоли.

В результате исследования архивного материала канцер-регистра пациентов, проходивших лечение в НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова с 2000 по 2009 г., в исследование включено 1240 пациентов. Распределение по стадиям было следующим:

• Т1 – 668 пациентов, из них 47 (7,0%) имели метастазы в лимфатических узлах (Т1а – 9, Т1b – 17, T1c – 132, у оставшихся 511 разделение на подкатегории не проводилось);
• Т2 – 560 пациентов, в том числе 58 (10,3%) c метастазами;
• Т3 – 10 пациентов, в том числе 5 (50%) с метастазами;
• Т4 – 2 пациента с метастазами в аксиллярных лимфоузлах.

Таким образом, РМЖ с метастазами в регионарных лимфатических узлах выявлен у 110 больных. Иными словами, согласно международной классификации TNM, у подавляющего большинства изученных пациентов (n = 1116 (90%)) выявлен ранний РМЖ.

Степень инфильтрации опухоли лимфоцитами определяли количественно, согласно рекомендациям International TILs Working Group 2014 [4]. Критерии оценки: группа A (слабое окрашивание) – 0–10% лимфоцитов в опухоли, группа B (умеренное окрашивание) – 11–59%, группа C (выраженное окрашивание) – 60–100%.

Всего TILs были оценены в 1172 случаях, в частности в 729 (62,2%) внутриопухолевая инфильтрация лимфоцитами была слабой (А), в 272 (23,2%) – умеренной (B) и в 171 (14,6%) случае – выраженной (C) (рис. 1).

Распределение степени инфильтрации TILs по стадиям (категория Т) было следующим:

• Т1 (оценено в 665 случаях) – 449 (67,5%) случаев – группа A, 129 (19,3%) случаев – группа B, 87 (13%) случаев – группа C;
• Т2 (оценено в 498 случаях) – 276 (55,4%) случаев – группа A, 140 (28,1%) случаев – группа B, 82 (16,4%) случая – группа С;
• Т3 (оценено в 9 случаях) – 4 случая – группа A, 3 случая – группа B, 2 случая – группа С.

В Национальном медицинском исследовательском центре онкологии им. Н.Н. Петрова первоначально использовали визуальный полуколичественный метод определения статуса TILs: 0–10% позитивно окрашенных лимфоцитов – 0 баллов, до 50% – 2 балла, свыше 50% позитивно окрашенных лимфоцитов – 2 балла (то есть высокий уровень окрашивания). Этот метод наряду с другими применяется при оценке выживаемости.

Для более подробной характеристики иммунного статуса и соотношения различных показателей проводится цифровой анализ изображений для каждого из исследуемых маркеров, включая процентное содержание CD3+, CD4+, CD8+-T-лимфоцитов в строме опухоли по отношению к общей клеточности опухоли (перерасчет в мм²).

Градация уровня CD3+-лимфоцитов представляется в трех группах: группа 1 – 0–5%, группа 2 – 5–20%, группа 3 – более 20%. Градация уровня CD4+-лимфоцитов представляется также в трех группах: группа 1 – 0–4%, группа 2 – 4–20%, группа 3 – более 20%. Уровень CD8+-лимфоцитов в строме опухоли также подразделяется на три группы: группа 1 – 0–2,5%, группа 2 – 2,5–10%, группа 3 – более 10%.

Оценка экспрессии иммунных «регуляторов» PD-L1 и FOXP3 представляется в двух группах: для PD-L1 группа 0 означает отсутствие экспрессии, определяемой методом ИГХ, группа 1 – наличие экспрессии. Для FOXP3 группа 0 означает любой уровень экспрессии, группа 1 – отсутствие экспрессии.

Классификация подтипов РМЖ (трижды негативный РМЖ (тнРМЖ), HER2-позитивный и люминальный HER2-негативный) была основана на ИГХ-исследовании и гибридизации in situ (для HER2 2+).

При реализации способа прогнозирования использовали автоматизированную обработку и анализ цифровых изображений исследуемых гистологических препаратов с помощью компьютерных программ. Процедура определения прогностического параметра является практически оператор-независимой, что повышает точность и объективность способа. На указанный способ прогнозирования РМЖ получен патент № 2697709.

Результаты

Статус СD3/CD4/CD8+-Т-лимфоцитов изучен в 281, 633, 548 случаях соответственно. Средние значения удельного веса СD3/CD4/CD8+-лимфоцитов на единицу площади опухоли представлены в таблице и на рис. 2. Как видно из таблицы, достоверной связи уровня инфильтрации CD3+, CD4+, CD8+ с размером опухоли категории pT не прослеживается (p = 0,78).

Подавляющее большинство пациентов (около 80%) имели низкие и средние показатели инфильтрации опухоли CD8+ и CD3+-Т-лимфоцитами.

Для оценки значимости иммунологических аспектов противоопухолевого ответа было изучено 638 случаев с регуляторными генами – PD, PD-L1 и FOXP3. В 281, 633, 548 случаях соответственно были также изучены маркеры Т-клеточного ответа CD3, CD4 (регуляторные лимфоциты) и CD8 (цитотоксические).

Проанализированы данные 638 пациентов с диагнозом инвазивного РМЖ. С помощью ИГХ-исследования для каждого больного определена экспрессия генов PD, PD-L1. Результаты ИГХ-окрашивания представлены на рис. 3.

Экспрессия белка PD-L1, который связывается с цитотоксическими лимфоцитами и блокирует их активность, является предметом пристального внимания. В нашем исследовании у 108 (8,7%) из 1240 больных выявлена экспрессия PD-L1. В 77 (71,2%) случаях одновременно обнаружена экспрессия CD8, в том числе в 50% случаев выраженная (более 50% от TILs).

Имеется достоверная связь (p = 0,02) увеличения частоты PD-L1+ опухолей с увеличением стадии заболевания. Среди исследуемых больных у 16,92% установлена экспрессия гена PD, PD-L1 в стромальных лимфоцитах, у 9,09% (58 пациентов) – экспрессия гена PD, PD-L1 в эпителиальных клетках опухоли. Анализ показал, что экспрессия гена PD, PD-L1 в эпителиальных клетках опухоли в 5% случаев от общего числа исследованных сопровождалась экспрессией гена PD, PD-L1 в лимфоцитах опухолевой стромы (рис. 4).

Экспрессия регуляторного гена PD-L1 при различных фенотипах РМЖ оценена у 333 пациентов. При люминальном подтипе A экспрессия PD-L1 выявлена лишь у 3 (1,5%) из 202 пациентов, у 199 (98,5%) тест оказался отрицательным.

При тнРМЖ экспрессия PD-L1 наблюдалась у 28 (29,5%) из 95 пациентов, у 67 (70,5%) тест отрицательный. У больных HER2-позитивным РМЖ экспрессия PD-L1 наблюдалась у 8 (18,2%) из 44 пациентов. У 36 (81,8%) PD-L1-тест отрицательный. Таким образом, экспрессия гена PD-L1 выявлена в 39 (11,7%) случаях из 333, реже (1,5%) при люминальном подтипе A, чаще (29,5%) при тнРМЖ (рис. 5).

Достоверно (p < 0,05) на уровень внутриопухолевых лимфоцитов во всех фракциях Т-клеточного ответа (CD3+, CD4+ (регуляторные лимфоциты) и CD8+ (цитотоксические)) влияет наличие экспрессии PD-L1 как на мембранах опухолевых клеток, так и на самих лимфоцитах (рис. 6).

Выживаемость и маркеры иммунологического ответа

Анализ показателей десятилетней выживаемости проведен у 1066 пациентов. В настоящее время известно, что биологическое поведение злокачественной опухоли, которое характеризует скорость ее роста, способность к инвазии и распространению, зависит от причин, связанных как с особенностями самой опухоли, так и с эффективностью или неэффективностью системных защитных механизмов, прежде всего иммунных. В связи с этим актуальным представляется поиск новых подходов к прогнозированию течения заболевания с помощью параметров, учитывающих качественный и количественный состав иммунокомпетентных клеток, в частности различных видов Т-лимфоцитов и их субпопуляций.

Используя высокопроизводительную систему тканевых матриц с одномоментным и однообразным исследованием панели маркеров, мы установили, что процентное содержание CD4+-Т-лимфоцитов в строме опухоли служит прогностическим признаком. При значении процентного содержания менее 20% прогноз можно расценивать как благоприятный. Другие типы оценок CD4+ не оказывали существенного влияния на прогноз заболевания.

У 296 из исследуемых больных определено процентное содержание CD4+ ≤ 20% (группы 1 и 2). Десятилетняя общая выживаемость в указанных группах достигла 93%. При РМЖ (стадии T1, Т2, N0) такие группы считаются статистически благоприятными. У 98 пациентов процентное содержание CD4+ превысило 50%. Десятилетняя общая выживаемость была достоверно ниже 82% (рис. 7).

Высокая степень (группа 3) лимфоидной инфильтрации, представленная CD3+, связана с более выраженной тенденцией к повышению безрецидивной выживаемости (р = 0,06) (рис. 8).

Лимфоидная инфильтрация, представленная CD8+, увеличивает безрецидивную и общую выживаемость, особенно при высоком уровне (> 10%).

Экспрессия PD-L1 (влияние на выживаемость)

Нами был предпринят анализ как безрецидивной (n = 122), так и общей выживаемости (n = 145) (рис. 9).

Безрецидивная выживаемость была достоверно (р = 0,0027) выше в группе опухолей без экспрессии PD-L1 – 70 против 41%, расхождение кривых выживания по кривой Каплана – Майера (р = 0,02).

Общая выживаемость оказалась выше в группе опухолей без экспрессии PD-L1 – 75 против 50% (p = 0,04) (рис. 9).

В многоцентровом исследовании NeoTRIPaPDL1 с участием Национального медицинского исследовательского центра онкологии им. Н.Н. Петрова (результаты исследования были представлены на ESMO-2020) сравнивали эффективность неоадъювантной терапии, включавшей ингибитор контрольных точек PD-L1 атезолизумаб в комбинации с химиотерапией карбоплатином и наб-паклитакселом, и эффективность только химиотерапии при тнРМЖ [5]. При промежуточной трепанбиопсии в первый день второго цикла терапии отсутствие опухолевых клеток регистрировалось у 28,8% больных, получавших атезолизумаб, и у 13,6% больных, получавших только химиотерапию карбоплатином и наб-паклитакселом.

Отсутствие опухолевых клеток при промежуточной биопсии можно считать предиктивным маркером достижения полного патоморфологического ответа (рСR) на неоадъювантную терапию.

В исследовании NeoTRIPaPDL1 достижение полного патоморфологического регресса (рCR) наблюдалось у 77,7% пациентов с отсутствием опухолевых клеток в промежуточной биопсии против 45,3% при их наличии (p = 0,023). Атезолизумаб «конвертировал» PD-L1-негативные опухоли, наблюдавшиеся у 45,4% больных, в позитивные у 74,6% пациентов. У тех, кто получал только неоадъювантную химиотерапию карбоплатином и наб-паклитакселом, выявлено снижение PD-L1-позитивности с 52,1 до 37,9% [5, 6].

Достижение полного патоморфологического регресса (pCR) на фоне применения атезолизумаба было наиболее высоким (86,9%) у пациентов «иммунообогащенной» группы (PD-L1-позитивные иммунные клетки (PD-L1-IC+)) или со стромальными TILs либо интратуморальными TILs по сравнению с пациентами той же группы, но получавшими только химиотерапию (72,0%; p = 0,02) [7–12].

Прогностическое значение экспрессии FOXP3

Экспрессия FOXP3 (показатели выживаемости) представлена на рис. 10.

Инфильтрация FOXP3-регуляторных Т-клеток в инвазивную опухоль ассоциируется с прогнозом и выживаемостью при многих опухолях. Прогностическое значение FOXP3-инфильтрирующих-опухоль лимфоцитов (TILs) при РМЖ остается противоречивым. FOXP3 TILs оценивали с помощью ИГХ-исследования на тканевых матрицах.

Проанализированы данные 620 больных инвазивным РМЖ. С помощью ИГХ-исследования в каждом случае определяли экспрессию гена FOXP3 (рис. 11).

Показано, что экспрессия регуляторного гена FOXP3 практически не изменяется при увеличении стадии заболевания, остается стабильной на всех стадиях – от рТ1 до рТ4 (рис. 12).

У 296 (47,74%) пациентов из 620 выявлена экспрессия FOXP3 в стромальных лимфоцитах, у 171 (27,5%) – в клетках опухоли. Только у 56 (9,03%) больных обнаружена ко-экспрессия гена FOXP3 как в опухоли, так и в окружающих ее стромальных лимфоцитах. Удельный вес CD3+, CD4+, CD8+ увеличивался по мере повышения уровня FOXP3 (рис. 13).

Наибольший интерес вызывает оценка соотношения цитотоксических лимфоцитов CD8 и регуляторного гена FOXР3. В нашем исследовании CD8+-лимфоциты выявлены в 201 (67,9%) из 296 FOXP3-позитивных случаев. Полученное соотношение 201:296 (0,68) свидетельствует о неблагоприятном прогнозе. Одновременная экспрессия регуляторных генов PD, PD-L1 и FOXP3 обнаружена у 66 (11,6%) из 569 больных.

Оказалось, что наличие экспрессии FOXP3 при ER+ РМЖ на внутриопухолевых лимфоцитах достоверно связано с более низким показателем общей выживаемости (p = 0,06).

Анализ литературы также показывает, что FOXP3 служит маркером неблагоприятного прогноза исхода заболевания, особенно в группе ER+ карцином, и фактором благоприятного прогноза в группе HER2+/ER-.

Как показано на рис. 14, при ко-экспрессии CD8+ и FOXP3 у пациентов с ER+/HER2+ РМЖ наблюдаются более низкие показатели десятилетней общей выживаемости (80 против 92% по сравнению с группой без ко-экспрессии; p = 0,048).

При многовариантном анализе показателей выживаемости высокий уровень FOXP3 TILs достоверно ассоциировался с низкой выживаемостью при ER+ РМЖ с отсутствием CD8+-T-клеточного инфильтрата (относительный риск 1,3). Однако при ER-негативных опухолях FOXP3 TILs отмечалась тенденция к улучшению выживаемости в HER2+/ER-подгруппе, особенно с высоким уровнем (> 20%) CD8+-Т-клеточного инфильтрата.

FOXP3-регуляторные TILs являются отягчающим прогностическим индикатором при HER2+/ER+ РМЖ, но благоприятным прогностическим фактором при HER2+/ER-подтипе РМЖ. Таким образом, прогностическая ценность FOXP3 TILs зависит от экспрессии и статуса ER и HER2 и инфильтрации CD8+-T-клетками.

Обсуждение результатов

Использование в качестве прогностического биомаркера лимфоцитарной инфильтрации опухоли (TILs) позволяет понять биологию тнРМЖ и HER2-позитивного РМЖ.

Были получены высокие результаты в исследовании пациентов с тнНРМЖ и оценкой соотношения CD8/FOXP3 на исходном уровне и в резидуальной опухоли. Показатель пятилетней безрецидивной выживаемости составил 72% у пациентов с высоким соотношением CD8/FOXP3 и 40% – у пациентов с низким соотношением CD8/FOXP3 (p = 0,009) [13].

В нашем исследовании при высоком соотношении (> 2) показатель безрецидивной выживаемости превысил 80%. При низком соотношении CD8/FOXP3 (0,68) показатель десятилетней безрецидивной выживаемости снизился до 47% (p = 0,02).

Патогенетический путь через экспрессию PD-1 и лиганда PD-L1 является главным регулятором иммунного ответа на растущую опухоль. В последние годы были разработаны моноклональные антитела, блокирующие иммунные checkpoint-белки. При РМЖ наиболее исследован препарат атезолизумаб (анти-PD-L1-антитело) [7–12, 14].

В исследовании Impassion 130 на фоне применения атезолизумаба (ингибитора лиганда PD-L1) в комбинации с наб-паклитакселом при метастатическом тнРМЖ отмечалось увеличение показателей двухлетней общей выживаемости в группе с позитивным PD-L1 [10–12].

В исследовании фазы III NeoTRip при нашем участии [14] при первом анализе статистически достоверной зависимости показателя pCR от добавления атезолизумаба не выявлялось во всей группе. Тем не менее частота pCR была выше у пациентов с PD-L1+ (p < 0,0001). Более поздняя оценка исследования NeoTrip, представленная на ESMO-2020 G. Bianchini [14], показала, что применение атезолизумаба в комбинации с карбоплатином и наб-паклитакселом увеличивает достижение полного патоморфологического ответа (pCR) более чем на 10% по сравнению с неоадъювантной химиотерапией.

Выводы

На основании полученных результатов было сформулировано несколько важных выводов.

Во-первых, выраженная (> 10%) лимфоцитарная инфильтрация CD8+, а также CD3+ при низкой экспрессии PD-L1 и FOXP3 улучшает безрецидивную и общую выживаемость пациентов с РМЖ.

Во-вторых, около 80% больных РМЖ имеют низкие уровни инфильтрации опухоли CD8+ цитотоксических Т-лимфоцитов и CD3+ TILs.

В-третьих, экспрессия гена PD-L1 чаще (29,5%) выявляется при тнРМЖ, в 1,5 раза реже (18,2%) при HER2+ РМЖ и крайне редко (1,5%) при люминальном подтипе A.

В-четвертых, подтверждена возможность достижения полного патоморфологического регресса опухоли (pCR) у 2/3 пациентов с экспрессией PD-L1 и экспрессией TILs, получавших атезолизумаб и неоадъювантную химиотерапию (карбоплатин + наб-паклитаксел).