Прогностическое и предиктивное значение Т-клеток памяти в периферической крови у больных неоперабельной или метастатической меланомой

Рис. 1. Развитие цитотоксических лимфоцитов из Т-клеток памяти и экспрессируемые ими маркеры (двойными стрелками указаны антагонистические взаимодействия между CTLA4 и CD28)

Таблица 1. Характеристика пациентов

Рис. 2. Схема исследования

Таблица 2. Статистически значимые факторы риска в многофакторных моделях ОВ и ВДП

Введение

Иммунотерапия является одним из ключевых элементов лечения меланомы. Значительные успехи в этом направлении были достигнуты благодаря разработке ингибиторов иммунного синапса – препаратов, блокирующих тормозное влияние на иммунную систему, препятствующее активации Т-клеток памяти и формированию из них эффекторных субпопуляций [1]. Данные методы оказались весьма эффективны. Однако существенная доля пациентов не отвечает на подобное лечение, и лишь в небольшом проценте случаев возможно излечение. Таким образом, очевидна необходимость поиска биомаркеров для персонализации лечения больных.

Т-клетки памяти представляют собой гетерогенную популяцию клеток, которые в своем развитии от наивных до эффекторных претерпевают ряд изменений [2]. На сегодняшний день существует несколько концепций и предположений развития этих клеток, но в целях данного исследования остановимся только на модели снижающегося потенциала (рис. 1).

Важно подчеркнуть, что именно на T-клетках памяти экспрессируется рецептор CD28, который конкурирует с рецептором CTLA4 за связывание с CD80 [3]. Данная связь служит сигналом второго типа в иммунном синапсе при встрече наивной Т-клетки или Т-клетки центральной памяти, способной к длительной персистенции и пролиферации, с антигеном и обеспечивает пролиферативный и антиапоптотический сигнал [2]. Напротив, активация CTLA4, имеющего большую аффинность к CD80, индуцирует апоптоз клеток и не приводит к их активации. Мы предположили, что уровень Т-клеток в периферической крови может быть маркером эффективности терапии и выживаемости больных меланомой. Для подтверждения выдвинутой нами гипотезы было проведено исследование.

Материал и методы

В исследование включены больные неоперабельной или метастатической меланомой, получавшие иммунотерапию ипилимумабом с 2012 по 2015 г. Основные критерии включения:

• подписание информированного согласия;
• возраст старше 18 лет;
• наличие морфологически подтвержденной неоперабельной или метастатической меланомы;
• отсутствие клинически значимых нарушений функции внутренних органов;
• отсутствие аутоиммунных заболеваний.

Характеристика пациентов представлена в табл. 1, схема исследования – на рис. 2. Для оценки иммунного статуса (ИС) измеряли содержание цитотоксических лимфоцитов (CTL, CD3⁺CD8⁺), наивных Т-лимфоцитов (Tn, CD3⁺CD45RA⁺CD62L⁺), центральных Т-клеток памяти (Tcm, CD3⁺CD45R0⁺CD62L⁺), клеток эффекторной памяти (Tem, CD3⁺CD45R0⁺CD62L^-).

Для оценки связи показателя с эффектом лечения сравнивали частоту отдельных видов ответа по системе RECIST (прогрессирование заболевания, стабилизация заболевания, объективный ответ) у пациентов с наличием или отсутствием отклонений уровня анализируемых популяций клеток от референсных значений (при их наличии). Ответ определяли как последний результат оценки состояния опухоли перед оценкой ИС (грубая оценка) и в пределах двух недель от оценки ИС (точная оценка). Для сравнения распределений ответов использовали метод хи-квадрат и статистику отношения правдоподобия. Для оценки выживаемости были построены прогностические модели, включавшие демографические показатели (пол, возраст), характеристики времени лечения (до начала терапии, начало лечения, продолжение лечения, после лечения, время на терапии в месяцах), стадию (III против IV) и подстадию (M0 и M1a–b против M1c) процесса на момент начала терапии, наличие повышенного уровня лактатдегидрогеназы и мутаций в гене BRAF, меланомы слизистой оболочки или увеальной меланомы, первично-множественных опухолей, иммуноопосредованных нежелательных явлений, линию терапии, вид проведенного ранее лечения. Время до прогрессирования (ВДП) измерялось от времени оценки ИС (для ИС, исследуемых до начала терапии, – от времени начала лечения) до выявления первых признаков прогрессирования процесса. Общая выживаемость (ОВ) рассчитывалась от той же точки, что и ВДП, до смерти по любой причине. Для соблюдения предположений модели о независимости признаков из нее исключались переменные с высоким (> 0,7) уровнем корреляции регрессионных остатков. При построении модели изучаемые факторы добавлялись к известным методам условного включения. В дальнейшем была также построена модель, включавшая все изучаемые факторы. Размер эффекта определялся для всех случаев относительным риском (ОР). В нашем исследовании использовался уровень значимости p < 0,05.

Результаты

При оценке уровня наивных Тn до начала терапии не установлено связи с максимальным эффектом лечения (р >0,05). При анализе всех ИС обнаружено, что снижение данной субпопуляции лимфоцитов (как в абсолютных, так и в относительных значениях) чаще ассоциировалось с прогрессированием заболевания (ОР 1,236 и ОР 1,173, р = 0,003 и р = 0,006 соответственно). При более детальном рассмотрении динамики состояния опухоли у больных, получавших ипилимумаб, выявлена аналогичная тенденция (p = 0,024). При этом различия в частоте стабилизаций процесса достигали статистически значимого уровня (р < 0,05). Относительные уровни показателей также существенно влияли на частоту отдельных категорий динамики состояния опухоли. Бурное прогрессирование чаще регистрировалось при сниженном относительном значении наивных Т-лимфоцитов (p < 0,05). При анализе выживаемости связи уровня наивных Т-лимфоцитов как до лечения, так и в процессе терапии с ОВ и ВДП не зафиксировано (р > 0,05).

При анализе прогностической роли Tcm и Тem оказалось, что при повышении первых риск смерти увеличивается (ОР 1,02; р = 0,02), тогда как с ростом вторых уменьшается (ОР 0,401; р = 0,008). Относительный уровень Tem служил также прогностическим фактором при анализе ВДП (ОР 0,961; р = 10^-5). При оценке уровней Т-клеток памяти до лечения связи с показателями выживаемости не обнаружено (р > 0,05).

Абсолютный уровень CD3⁺CD27⁺CD62L⁺ являлся благоприятным фактором прогноза ОВ (ОР 0,529, р = 0,001), тогда как относительный уровень CD3⁺CD28⁺CD62L⁺ лимфоцитов – неблагоприятным (ОР 1,012; р = 0,009). При этом данные показатели не влияли на риск прогрессирования заболевания (р > 0,05). Уровень CD3⁺CD27⁺CD62L⁺ и CD3⁺CD28⁺CD62L⁺ лимфоцитов до лечения не был связан с показателями ОВ и ВДП (p > 0,05).

Уровень CTLA4-лимфоцитов служил неблагоприятным фактором прогноза ВДП только при его оценке до начала терапии (ОР 1,045; р = 0,037).

При построении общей многофакторной модели, учитывавшей все анализируемые нами субпопуляции (табл. 2), оказалось, что с повышением уровня эффекторных субпопуляций у пациентов снижался риск прогрессирования заболевания и смерти, тогда как при накоплении клеток Tcm, наоборот, возрастал. Можно предположить, что сказанное свидетельствует о необходимости обеспечения успешной активации Т-лимфоцитов, достижение которой на фоне лечения транслируется в повышение продолжительности жизни пациентов.

Обсуждение

Наивные Т-клетки CD3⁺/CD45RA⁺/CD62L⁺ распознают чужеродные антигены, представленные в аспекте молекул главного комплекса гистосовместимости, циркулируют в периферических органах иммунной системы, Т-зависимых зонах вторичных лимфоидных органов и периферической крови, считаются «наивными» до контакта с антигенпрезентирующими клетками. Изучаемые клетки еще не приобрели эффекторные свойства, необходимые для реализации противоопухолевого иммунного ответа, и, по всей вероятности, именно поэтому полученные нами результаты по увеличению доли этих клеток у пациентов с прогрессированием заболевания позволяют нам рассматривать накопление в циркуляции Т-клеток, полностью лишенных эффекторных свойств, в качестве маркера неблагоприятного прогноза [2–5].

Интерес к популяции Т-лимфоцитов с иммунофенотипом «наивные» вызван исследованиями, в которых показано, что среди этой популяции могут быть «наивно-ревертантные» клетки. Считается, что первичная стимуляция Т-клеток запускает однонаправленную дифференцировку от наивных к эффекторным субпопуляциям и клеткам памяти. Вместе с тем G. Frumento и соавт. (2020) показали, что интерлейкин 7 может привести к фенотипической реверсии недавно дифференцированных CD8⁺ Т-клеток центральной и эффекторной памяти человека в наивный фенотип. Эти «наивно-ревертантные» клетки CD45RA⁺/CD62L⁺/CCR7⁺/CXCR3⁺ демонстрируют фенотип, аналогичный фенотипу ранее зарегистрированных популяций клеток памяти «стволовых клеток», они подвергаются быстрой дифференцировке и функциональному ответу после вторичной стимуляции [6].

Фенотипическая реверсия по крайней мере частично объясняет генерацию CD8⁺ Т-клеток памяти «стволовых клеток» и выявляет клетки в фенотипически наивном пуле CD8⁺ Т-клеток, которые эпигенетически настроены на вторичную стимуляцию. Такая информация дает представление о механизмах, которые поддерживают Т-клетки памяти и могут направлять терапевтические манипуляции с дифференцировкой в центральные и эффекторные Т-клетки памяти [7].

В ряде исследований центральные Т-клетки памяти CD3⁺/CD45R0⁺/CD62L⁺ демонстрировали более высокую функциональную активность и противоопухолевый иммунитет по сравнению с эффекторными Т-клетками памяти CD3⁺/CD45R0⁺/CD62L^-, которые являются терминально дифференцированными клетками памяти, циркулируют в периферической крови, вторичных лимфоидных органах, достигают эффекторной функции и истощения функциональной активности вскоре после повторной стимуляции [8–10].

Наличие адгезионной молекулы CD62L и хемокинового рецептора CCR7 на поверхности Т-клеток центральной памяти позволяет отличить данную популяцию от Т-клеток эффекторной памяти, лишенных указанных молекул.

В нашем исследовании ассоциация увеличения Т-клеток центральной памяти с неблагоприятным исходом заболевания может быть тесно связана с биологией этих клеток. Эта особенность Т-клеток центральной памяти, с одной стороны, позволяет им длительное время циркулировать в организме, с другой, определяет преимущественную локализацию во вторичных лимфоидных органах и не позволяет мигрировать в очаги опухолевого роста, равно как и не подразумевает наличие у Т-клеток центральной памяти эффекторных свойств, необходимых для разрушения опухоли [11].

Принципиальным отличием Т-клеток эффекторной памяти от Т-клеток центральной памяти является выраженная способность к продукции эффекторных цитокинов и проявлению цитолитической активности в отношении клеток-мишеней [10, 12, 13]. Более того, на этой популяции клеток возрастают экспрессия молекул «хоуминга» и миграция в воспаленные ткани. Возможно, именно поэтому нами выявлена тесная взаимосвязь между ростом этих клеток в циркуляции у пациентов с благоприятным течением заболевания.

Наличие на поверхности Т-лимфоцитов ко-стимулирующих молекул CD27 и CD28 позволяет клеткам активироваться и развивать антигенспецифический ответ in vivo при наличии антигенной стимуляции и лигандов для указанных выше молекул на мембране антигенпрезентирующих клеток, что было показано в экспериментах на мышах [14]. Если циркулирующие Т-хелперы практически всегда экспрессируют обе эти молекулы на своей поверхности, то среди общего пула цитотоксических CD8⁺ Т-лимфоцитов наблюдается существенное изменение в их экспрессии [15]. Цитотоксические Т-лимфоциты с фенотипом CD28⁺CD27^high получили название наивных непраймированных Т-клеток. В их цитоплазме не обнаруживались цитотоксические гранулы, но на мембране экспрессировались CD45RA и CCR7. Антиген CCR7 также был обнаружен на популяции клеток с фенотипом CD28⁺CD27^high-to-posCD45RA^-, получивших название ранних антиген-праймированных CD3⁺CD8⁺-лимфоцитов. И наконец, клетки, лишенные CD27 и CD28, получили название поздних цитотоксических Т-клеток. Кроме того, была выделена популяция промежуточных клеток с фенотипом CD28^-CD27⁺. По мере утраты CCR7, CD27 и CD28 возрастала способность клеток синтезировать эффекторные цитокины, проявлять цитотоксические свойства по отношению к клеткам-мишеням, синтезировать и накапливать цитолитические гранулы, но одновременно снижалась способность к пролиферации. При этом по мере созревания Т-лимфоцитов утрата CD28 предшествует снижению CD27, а переход из состояния CD27⁺CD28^- рассматривается как один из ключевых переходов в сторону эффекторных клеток [8, 16]. Не случайно полученные нами данные об увеличении числа CD3⁺CD27⁺CD62L⁺ Т-клеток рассматривались как благоприятный фактор прогноза ОВ. В то же время накопление CD3⁺CD28⁺CD62L⁺ Т-лимфоцитов, находившихся на самых ранних стадиях дифференцировки и лишенных эффекторных свойств, было связано с неблагоприятным прогнозом.

Таким образом, генерация, дифференцировка и поддержание Т-клеток памяти в функционально оптимальном состоянии имеют решающее значение для эффективности формирования противоопухолевого иммунитета, в том числе на фоне применения иммуноонкологических препаратов при меланоме.

Недавние исследования способствовали открытию Т-клеток памяти, резидентных в тканях, и расширили наши знания о транскрипционных и эпигенетических основах дифференцировки и дисрегуляции CD8⁺ Т-клеток [3].

К сожалению, прогресс иммунотерапии находится на критическом этапе, поскольку эффективность иммуноонкологических препаратов ограничивается небольшой долей пациентов и часто не обеспечивает долговременную пользу от лечения [3, 5, 9, 10, 12, 15]. Раскрытие потенциала иммунотерапии требует разработки стратегий, которые одновременно индуцируют мощный эффекторный ответ и надежно формируют стабильные функционально активные пулы Т-клеток памяти, способные предотвратить рецидив или дальнейшее прогрессирование заболевания. Крайне важно, чтобы основные и новые концепции, обновленные знания о биологии Т-клеток памяти были своевременно использованы в разработках иммунотерапии рака.

Заключение

Проведенное исследование дополняет системное понимание механизмов, лежащих в основе дифференцировки Т-клеток памяти. Все большее значение приобретает определение их уровня до и в процессе иммунотерапии, что служит значимым фактором прогноза заболевания. Необходимы дальнейшие проспективные клинические исследования в данном направлении.